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.2012年10月17日；32(42):14835-48.
doi:10.1523/JNEUROSCI.1544-12.2012。

成人皮层突触前HCN1通道的TRIP8b非依赖性转运和可塑性

卓晃 1, 拉斐尔·卢扬, 何塞·马丁内斯·赫南德斯, 艾伦·S·刘易斯, 戴恩·切特科维奇, 马拉·M·沙阿
附属公司

成人皮层突触前HCN1通道的TRIP8b非依赖性转运和可塑性

卓晃等。 神经科学. .

摘要

超极化激活的环核苷酸门控（HCN）通道是亚阈值激活的电压门控离子通道。在皮层，这些通道主要表达在树突中，它们显著改变树突的内在兴奋性以及突触电位的形状和整合。HCN向树突的通道运输受TRIP8b蛋白调节。此外，TRIP8b表达的改变可能是癫痫诱导的树突状HCN通道可塑性的机制之一。然而，HCN通道也位于某些成熟的皮层突触终末，在调节突触传递中起着至关重要的作用。在这项研究中，使用电生理记录和电子显微镜，我们发现突触前（而不是树突）皮层HCN通道的表达和功能在成年TRIP8b缺失小鼠和野生型同窝出生的小鼠中具有可比性。我们进一步研究了突触前HCN通道是否具有癫痫依赖性可塑性。我们发现，与树突状通道一样，在红藻氨酸诱导癫痫发作后，野生型突触前HCN通道功能持续下降。由于TRIP8b不影响突触前HCN亚单位的运输，因此这些皮层HCN通道的癫痫依赖性可塑性并不取决于TRIP8b。因此，我们的结果表明，成人神经元中HCN亚单位靶向、表达和可塑性的分子机制是具有隔室选择性的，这为严重依赖HCN通道功能的突触前和突触后过程可能受到明显影响提供了一种手段。

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图1。
图1。
突触前HCN1通道抑制增强自发兴奋性突触传递不受TRIP8b缺失的影响。A（i），野生型（Wt）和TRIP8b（行程8b）−/−EC第III层神经元。刻度显示50μm，适用于两幅图像。A（ii）、野生型Sholl分析和TRIP8b（行程8b）−/−EC第三层锥体神经元（见材料和方法）。近端树突树代表在特定半径内计数的顶端树突、斜树突和基底树突。B（i）,C（i）、从野生型和TRIP8b（行程8b）−/−HCN通道阻滞剂ZD7288（ZD；15μ米). 记录道上方显示了−70 mV时的向外保持值。右侧显示了每个示例的累积概率曲线。插图中显示了控制条件下（黑色）和ZD7288之后（红色）记录道的平均归一化mEPSC。所示比例B（i）和C（i）适用于各个面板内的所有轨迹。B（ii）,C（ii），图中描绘了从野生型和TRIP8b型−/−ZD7288存在和缺失时的神经元。观察次数显示在图表上方。重要性*第页< 0.05.B（三）,C（三），野生型和TRIP8b（行程8b）−/−神经元在控制条件下和20分钟后外部应用ZD7288。
图2。
图2。
野生型和TRIP8b-null神经元中HCN通道抑制剂对PPR的类似调节。A（i）,B（i），野生型（Wt）中以20 Hz频率诱发的EPSC对示例TRIP8b（行程8b）−/−外涂ZD7288（ZD，15μ米). −70 mV的向外保持电流在迹线上方表示。在每一对脉冲之间，用一个单一刺激诱发EPSC。从成对的EPSC中减去该EPSC，即可获得单个EPSC的振幅和形状。插图显示了在缺少和存在外部ZD7288的情况下叠加的第一条EPSC（黑色）和第二条EPSC减去的记录道。ZD7288在6种野生型和4种野生型中20分钟浴敷引起PPR变化的时间过程TRIP8b（行程8b）−/−神经元如下图所示。中显示的EPSC控制对的比例尺A（i）和B（i）适用于涂抹ZD7288后获得的产品。中插入内容的垂直和水平比例尺A（i）分别为50 pA和100 ms，而B（i）代表40 pA和100 ms。A（ii）,B（ii），图表显示了从8个野生型和9个野生型中获得的单个（开平方）和平均（填充平方）PPR值TRIP8b（行程8b）−/−神经元在控制条件下和20分钟后应用15μ米ZD7288。C–E类，描绘野生型和TRIP8b（行程8b）−/−神经元在有无外源性ZD7288的情况下。每个组的观察次数显示在条形图上方。重要性*第页< 0.05.
图3。
图3。
TRIP8b突触后特性的改变−/−EC第III层神经元A（i）,A（ii）、由野生型（Wt）和TRIP8b（行程8b）−/−当施加一系列400ms超极化和去极化电流步骤时，正常RMP处的胞体和树突分别为。RMP值显示在记录道上。右侧显示了在正常RMP下对给定去极化电流注入的响应所产生的平均尖峰数。所示的比例尺适用于两条记录道。B（i），示例野生型和TRIP8b（行程8b）−/−当从−70 mV的电位施加400 ms、100 pA超极化脉冲时，获得体细胞和树枝状痕迹。这些痕迹用于计算R（右）N个.B（ii），显示平均体细胞和树突的条形图R（右）N个野生型和TRIP8b（行程8b）−/−神经元。观察次数显示在条形图上方。重要性*第页< 0.05.
图4。
图4。
增强的树突兴奋性TRIP8b（行程8b）−/−神经元是由于HCN通道功能降低。A（i）,A（iii），野生型（Wt）和TRIP8b（行程8b）−/−EC第III层锥体体对从−150 pA到+200 pA的一系列400 ms超极化和去极化步骤作出响应。RMP值在记录附近说明。在控制条件下，在20分钟的浴中涂抹ZD7288（ZD；15μ米). ZD7288导致野生型RMP超极化，因此在超极化RMP（HRMP）和原始RMP（ORMP）上进行记录。中控制轨迹的比例尺A（i）和A（iii）适用于这些面板中显示的其他轨迹。A（ii）,A（iv），图中描述了在野生型和非野生型ZD7288存在和不存在的情况下，以给定400 ms去极化电流注入记录的动作电位数（AP号）的平均和标准误差TRIP8b（行程8b）−/−索马。当ZD7288对野生型RMP超极化时，显示了HRMP和ORMP处给定电流注入产生的平均尖峰数。B类,C类，条形图显示RMP和R（右）N个野生型和TRIP8b（行程8b）−/−施用ZD7288 20分钟前后的体细胞。每组的观察次数显示在条形图上方。D（i）,D（三），从野生型和TRIP8b（行程8b）−/−在没有和存在ZD7288的情况下，EC第三层树突距体细胞150–200μm。为了获得记录，应用400 ms的平方脉冲，从−300 pA到+200 pA。由于应用ZD7288导致野生型RMP超极化，因此在HRMP和ORMP处获得了记录道。记录道旁边注明了RMP值。为控件显示的比例尺适用于面板内的所有轨迹。D（ii）,D（iv），野生型和TRIP8b（行程8b）−/−在控制条件下和应用ZD7288后，树枝晶分别对ORMP中给定的400ms去极化步骤作出响应。E类,F类，平均RMP和R（右）N个以野生型和TRIP8b（行程8b）−/−在控制条件下和施用ZD7288后的枝晶。每个组的观察次数显示在条形图上方。重要性*第页< 0.05.
图5。
图5。
由于TRIP8b缺失树突中HCN通道功能降低，突触后EPSP整合增强。A（i），野生型（Wt）中在−70 mV下获得的单个树枝状αEPSP的示例TRIP8b型−/−在控制（con）条件下和施用15μ米ZD7288（ZD）。A（ii），图中显示了野生型ZD7288前后单个αEPSP的振幅和衰减时间常数（τ），以及TRIP8b（行程8b）−/−树突。每组的观察次数显示在条形图上方。B（i），野生型αEPSP系列在−70 mV电压下以50 Hz频率的代表性记录，以及TRIP8b（行程8b）−/−在没有（con）和有ZD7288（ZD）的情况下出现树枝晶。B（ii），在控制条件下和ZD7288之后，从频率为50 Hz或20 Hz的αEPSP序列中获得的6种野生型和6种TRIP8b（行程8b）−/−树突。每个符号代表平均值和SEM。通过将第五个αEPSP的振幅除以第一个的振幅来计算总和比率。野生型和TRIP8b（行程8b）−/−比较总和比率的显著性。在没有和存在ZD7288的情况下获得的比率也进行了显著性评估。在A类和B类，重要性*第页< 0.05.
图6。
图6。
改变TRIP8b EC组织中的树突状而非突触前HCN1亚单位分布。A类,B类，HCN1在野生型（Wt）树突和突触终末EC浅层的免疫反应性，如预埋免疫金方法所示。HCN1免疫颗粒位于树突棘（s）和树突轴（Den）突触外质膜（箭头）上的突触后位置，与轴突末端（b）形成突触，并与细胞内膜相关（交叉箭头）。在轴突末端的突触前部位（箭头）也检测到相当比例的HCN1免疫颗粒（b）。C类,天，HCN1免疫反应性TRIP8b型−/−EC表面树突和突触终末。与野生型组织相比，更多的颗粒位于细胞内（交叉箭头），而不是沿着树突状棘和树干的突触外质膜（箭头）。中的比例尺A类表示0.2μm，适用于中所示的所有示例A–D.E类，从3个野生型和3个TRIP8b型−/−老鼠。虽然在TRIP8b（行程8b）−/−树突与野生型相比，差异不显著（ns）。F类,G公司，对存在于3种野生型和3种野生类型的超薄切片中的树突和轴突的质膜和胞浆中的免疫金颗粒进行定量TRIP8b型−/−老鼠。重要性*第页< 0.05.
图7。
图7。
癫痫发生后HCN蛋白表达降低。A类24小时前用SP（30 mg/kg，皮下注射）或红藻氨酸（20 mg/kg，腹腔注射）和SP（SE动物）处理的动物的内嗅皮层（EC）中用预埋免疫过氧化物酶法进行HCN1亚单位免疫组化分析。染色模式代表了从3只不同的SP和3只SE小鼠获得的数据。HCN1在EC浅层（包括SP小鼠的第I、II和II层）中的免疫反应性很强，而在SE小鼠的相同层中则显著降低。比例尺，500μm。B（i）,C（i），应用ZD7288（15μ米)分别取自24小时SP和24小时SE小鼠急性切片中的EC第III层树突。通过施加400 ms的超极化和去极化电流阶跃（从−300 pA到+200 pA，以50 pA为增量）来获得记录。神经元的RMP显示在每次记录的旁边。浴敷ZD7288导致SP神经元中RMP超极化，因此显示了超极化RMP（HRMP）和原始RMP（ORMP）处获得的痕迹。第一条记录道显示的比例尺适用于此面板中的所有记录道。B（ii）,C（ii），图中描绘了24小时SP、24 SE、1周SP和1周SE神经元对去极化电流注入的反应所记录的平均动作电位数（AP号）(我)在没有和有ZD7288的情况下执行步骤。天,E类、显示RMP和R（右）N个含和不含ZD7288的SP和SE神经元的值。每个治疗组的观察次数显示在每个条形图上方。R（右）N个通过在所有神经元中施加400 ms超极化脉冲，从-70 mV的固定电位获得值。重要性*第页< 0.05.
图8。
图8。
突触前HCN通道功能的降低有助于癫痫发生后增强自发兴奋性突触传递。A（i）,（iv）,B（i）,（iv），从24小时或1周前用SE或对照（SP）诱导的小鼠获得的EC III层神经元进行的实例mEPSC记录。记录是在控制条件下，用15μ米ZD7288（ZD）。轨迹上方的值表示−70 mV的向外保持电流。每个记录的累积概率曲线显示在右侧。使用ZD7288之前（黑色）和之后（红色）的平均标准化mEPSC如插图所示。中轨迹的每个水平和垂直比例尺A（i）,A（iv）,B（i）、和B（iv）分别表示100ms和10pA，并适用于每个面板内的两个记录。A（ii）,（五）,B（ii）,（五），分别描绘了24 h SP、24 h SE、1 wk SP和1 wk SE神经元中ZD7288缺失和存在时的单个（开平方）和平均（填充平方）mEPSC频率的图形。图表上方显示了每组的观察次数。A（iii）,（vi）,B（三）, B（vi）,ZD7288分别作用于24小时SP、24小时SE、1周SP和1周SP神经元前后mEPSCs的振幅直方图。A类和B类，重要性*第页< 0.05.
图9。
图9。
癫痫诱导后突触前HCN通道功能降低导致诱发的突触传递增加。A（i）,（ii），仅在24小时SP治疗或在对照条件下诱导SE后，或在20分钟应用ZD7288（15μm米; ZD）。迹线上方的值是−70 mV时的外向保持电流。在对之间也激发出单个EPSC，并从对中减去这些EPSC，以获得对中单个EPSC的振幅和动力学。插图显示了第一个（黑色）和第二个（灰色）EPSC在没有和有外部ZD7288的情况下的重叠。轨迹右侧的图表描述了24小时SP和SE神经元应用ZD7288前后的个体（开平方）和平均（填充平方）PPR。观察次数显示在符号上方。中为控制对和单个（插图）显示的比例尺A（i）和A（ii）适用于涂抹ZD7288后获得的产品。A（iii），ZD7288对3SP和3SE神经元PPR影响的时间进程。B（i）,（ii）例，从1周龄SP和SE小鼠获得的EC第III层金字塔中的成对和单个（插入）诱发EPSCs。显示了应用ZD7288 20分钟之前和之后的记录。带有和不带ZD7288的单个（开平方）和平均值（填充平方）PPR如右图所示。每个治疗组的观察次数如图所示。在控制条件下为成对和单个EPSC显示的比例尺适用于显示ZD7288影响的记录道。重要性*第页< 0.05.
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