The p53-induced gene Ei24 is an essential component of the basal autophagy pathway

doi:10.1074/jbc.M112.415968

.2012年12月7日；287（50）：42053-63。

doi:10.1074/jbc。M112.415968。 Epub 2012年10月16日。

p53诱导的基因Ei24是基础自噬途径的重要组成部分

严国钊（Yan G Zhao）¹, 赵红玉, 林苗, 李旺, 孙飞, Hong Zhang（张红）

附属公司

PMID： 23074225
预防性维修识别码：项目经理3516751
内政部： 10.1074/jbc。M112.415968号

p53诱导的基因Ei24是基础自噬途径的重要组成部分

严国钊（Yan G Zhao）等。生物化学杂志. 2012.

.2012年12月7日；287（50）：42053-63。

doi:10.1074/jbc。M112.415968。 Epub 2012年10月16日。

作者

严国钊（Yan G Zhao）¹, 赵红玉, 林苗, 李旺, 孙飞, Hong Zhang（张红）

附属

¹中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室，北京100101。

PMID： 23074225
预防性维修识别码：项目经理3516751
内政部： 10.1074/jbc。M112.415968号

摘要

Ei24是一个参与生长抑制和凋亡的DNA损伤反应基因。然而，人们对Ei24的生理功能知之甚少。在这里，我们生成了Ei24的条件敲除小鼠，并证明了Ei24是基础自噬途径的一个重要组成部分。患有神经特异性Ei24缺乏症的小鼠会出现年龄依赖性神经异常，这是由大脑和脊髓中的大量轴突变性和广泛神经元丢失引起的。值得注意的是，Ei24的消融导致少突胶质细胞空泡化和轴突脱髓鞘。肝特异性Ei24缺失导致严重的肝细胞肥大。Ei24缺乏损害自噬通量，导致LC3、p62聚集体和泛素阳性内含物的积累。我们的研究表明，Ei24是一个重要的自噬基因，在清除神经元和肝细胞中的聚集倾向蛋白方面发挥着重要作用。

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数字

**图1。**
**运动和行为缺陷*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*老鼠。** A类，生成方案*Ei24（Ei24）*条件敲除小鼠。外显子描述为*黑匣子*通过侧翼的第3外显子制备靶向结构*Ei24（Ei24）*和neo^第页基因和loxP位点(*三角形*). 被删除的等位基因*Ei24（Ei24）*由Cre介导的重组产生，以去除外显子3。B类、雀巢*Cre公司*有效去除*Ei24（Ei24）*在脑组织中。从大脑、小脑和脊髓中制备总RNAEi24（Ei24）^{弗洛克斯/+}; 巢穴-*Cre公司*和*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*4个月大的小鼠。转录水平*Ei24（Ei24）*mRNA标准化为*肌动蛋白*mRNA。结果至少代表了三个实验。C类，体重曲线*Ei24（Ei24）^{弗洛克斯/+}*; 巢穴-*Cre公司*和*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*16周以上的小鼠。显示了18只小鼠的平均值±S.E。D类，生存曲线*Ei24（Ei24）^{弗洛克斯/+}*; 巢穴-*Cre公司*(n个=18）和*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*老鼠(n个=18）小鼠超过19周。E类当被尾巴举起时，*Ei24（Ei24）^{弗洛克斯/+}*; 巢蛋白-*Cre公司*小鼠伸展四肢*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*小鼠有一种异常的肢体反射，呈蝙蝠状姿势。F类，在自动加速杆上花费的时间。最大观察时间为120 s。显示了9只小鼠的平均±s.E。*G公司*，何时*Ei24（Ei24）^{弗洛克斯/+}*; 巢穴-*Cre公司*小鼠开始运动，后肢保持在后超伸位置。

**图2。**
**轴索变性和神经元丢失*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*老鼠。** A类大脑皮层和海马的Nissl染色*Ei24（Ei24）^{弗洛克斯/+}*; 巢穴-*Cre公司*和*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*4个月大的小鼠。这个箭头表示侧脑室扩大。酒吧，200微米。B类第五层皮层Nissl染色。该图显示了每毫米大金字塔细胞的数量²在所指示的区域中。显示了三只小鼠的平均值±S.E。棒材，50μm。C类海马锥体细胞层H&E染色。锥体细胞的数量被量化并除以层的长度。显示了三只小鼠的平均值±S.E。棒材，50μm。D类与对照小鼠相比，大脑尼塞尔染色显示大量空泡细胞(箭头)在扣带回皮质和内囊*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*老鼠。棒，50μm。E类，抗CNPase染色显示，空泡化细胞是CNPase阳性的少突胶质细胞，位于大脑扣带回皮质和内囊*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*老鼠。棒材，10μm。F类，抗CNPase的髓磷脂染色显示*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*4个月大的小鼠。棒材，100μm。*G公司*H&E染色显示小脑的叶状结构较少(箭头)然后裂开了*第24页^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*4个月龄的小鼠。棒材，500μm。*H（H）*分子层厚度，通过将小叶III和IV或小叶V和VI之间的距离除以2计算。显示了五只小鼠的平均值±S.E。我对照和突变小鼠Purkinje细胞的H&E染色。小叶III、IV和V中Purkinje细胞的数量被量化，并除以小叶的总长度。显示了五只小鼠的平均值±S.E。棒材，50μm。J型，抗钙结合蛋白(绿色)和抗MBP(红色)共同训练揭示了这一点*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*小鼠出现扩张的钙结合蛋白阳性球(箭头)在DCN区域中，并且一些球茎被MBP标记的髓鞘包裹。棒材，10μm。*K–M公司*，DCN的EM图片*Ei24（Ei24）^{弗洛克斯/+}*; 巢穴-*Cre公司*和*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*4个月龄的小鼠。*K（K）*在对照动物的DCN区域，有髓轴突形状和大小规则。(*L–M（L–M）*)，突变小鼠的退化轴突。我,箭头表示电子致密的非晶结构。这个箭头显示髓鞘变薄。*M（M）*,箭头显示髓鞘板层起伏和分裂。请注意，突变样本中的轴突明显少于对照组。棒材，1μm(*K–M公司*).N个，每毫米中间神经元的数量²在腰椎脊髓中。显示了五只小鼠的平均值±S.E。*O（运行）*4个月时，突变体小鼠腰椎脊髓前角空泡状细胞积聚。棒材，100μm。*P（P）*，GFAP信号(红色)在用抗GFAP抗体免疫染色的大脑皮层切片中，在突变小鼠中更强。棒材，20μm。

**图3。**
**大脑、小脑和脊髓的渐进性恶化*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*老鼠。** A类对照组和*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*不同年龄组的小鼠表现为空泡细胞的进行性积累。棒材，100μm。B类和C类，Purkinje细胞数量(B类)分子层的厚度(C类)在小脑中*第24页^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*不同年龄段的小鼠。D类，β-微管蛋白III共染色(绿色)和第62页(红色)在大脑中，轴突纤维逐渐变得更加不规则。p62聚集体和p62在*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*也会随着年龄的增长而急剧升高。棒材，10μm。E类DCN区Purkinje细胞的轴突终末被抗钙结合蛋白染色后，逐渐扩大。棒材，10μm。

**图4。**
**神经缺失患者LC3-II、p62聚集体和泛素阳性内含物的积累*Ei24（Ei24）*老鼠。** A类、大脑和脊髓总蛋白*Ei24（Ei24）^{弗洛克斯/+}*; 巢穴-*Cre公司*和*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*用SDS-PAGE对4个月龄小鼠进行提取和分离，并用抗LC3抗体进行免疫印迹分析。结果代表了至少三个实验。B类，抗LC3(红色)染色显示*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*小鼠脊髓DCST（背皮质脊髓束）呈现较强的弥漫性LC3信号。棒材，10μm。C类，一些LC3点与p62聚集体在海马的肺泡内共定位*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*4个月龄的小鼠。棒材，10μm。D类,*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*4个月龄的小鼠用p62抗体免疫印迹显示p62在大脑和脊髓中蓄积。结果至少代表了三个实验。E类免疫印迹分析显示大脑和脊髓中洗涤剂可溶部分和洗涤剂不可溶部分的多泛素化蛋白质(*联合国安全理事会*)对照和突变小鼠的匀浆。结果代表了至少三个实验。F类，p62聚集体在脊髓前角缺失*Ei24（Ei24）^{弗洛克斯/+}*; 巢穴-*Cre公司*老鼠。p62聚集体(红色)在3周、1个月和4个月大的突变小鼠中逐渐积累。弥漫性p62水平也升高，尤其是在空泡细胞中(箭头). 棒材，10μm。*G公司*抗CNPase和抗p62共染色显示，与对照组相比，弥漫性p62和大多数p62聚集体位于大鼠扣带回皮质的CNPase阳性少突胶质细胞中*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*老鼠。棒材，10μm。*H（H）*，与对照动物相比，p62(红色)和泛素化蛋白(绿色)在大脑切片中聚集和共定位*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 巢穴-*Cre公司*老鼠。p62聚集体比泛素化蛋白内含物数量多。棒材，10μm。

**图5。**
**活体特定删除*Ei24（Ei24）*导致肝肿大和自噬缺陷。** A类，代表性肝脏的大体解剖图*Ei24（Ei24）^{弗洛克斯/+}*; 阿尔布-*Cre公司*和*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 阿尔布-*Cre公司*3个月大的小鼠。生活在*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 阿尔布-*Cre公司*小鼠被放大。B类图中显示了对照和突变小鼠的肝脏净重和肝脏/体重比。显示了3只小鼠的平均值±S.E。C类，对照和突变小鼠的H&E染色肝切片显示*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 阿尔布-*Cre公司*老鼠。插图显示放大倍数更高的视图。棒材，50μm。D类，肝脏的大体解剖*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 阿尔布-*Cre公司*10个月大的小鼠出现多发肿瘤样突起(箭头).E类肝脏切片的H&E染色*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 阿尔布-*Cre公司*10个月大的小鼠(*第一个面板*). 这个箭头表示肿瘤样突起。棒材，100μm。对照组肝脏的高倍图像(*第二个面板*)和*Ei24（Ei24）*-缺陷小鼠(*第三个面板*，突出区域）。棒材，20μm。F类LC3-II、p62和多泛素化蛋白在肝脏中的积累*第24页^{flox/flox公司}*; 阿尔布-*Cre公司*老鼠。提取肝和脾总蛋白，用SDS-PAGE分离，并用抗LC3和抗p62抗体进行免疫印迹分析。用抗泛素和抗p62抗体对肝匀浆中的洗涤剂可溶性和不溶于洗涤剂的部分进行免疫印迹。*G公司*，与抗p62联合免疫(红色)和抗泛素(绿色)抗体显示p62和泛素阳性聚集物在对照肝切片中不存在，但在肝切片中大量积聚*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 阿尔布-*Cre公司*老鼠。突变肝脏中p62聚集体与泛素阳性内含物共定位。棒材，10μm。*H（H）*，用抗Nqo1抗体进行免疫印迹显示*Ei24（Ei24）^{flox/flox公司}*; 阿尔布-*Cre公司*老鼠。Nrf2水平在控制中保持不变*Ei24（Ei24）*-肝脏缺乏。我,*Gstm1型*,*编号1*、和*Cyp2a5基因*mRNA水平增加*Ei24（Ei24）*-缺陷小鼠。这个*Gstm1号机组*,*编号1*、和*Cyp2a5基因*转录水平归一化为肌动蛋白mRNA。结果至少代表了三个实验。

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