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.2012年11月30日；287(49):41103-17.
doi:10.1074/jbc。M112.416545。 Epub 2012年10月16日。

一种新的调节因子将核小体重塑复合体招募到小鼠胚胎干细胞中的无翼整合（Wnt）信号基因启动子

杰弗里·J·金 1, 奥马尔·哈立德, Sheynie Vo公司, 孙和云, 大卫·T·W·王, 金勇（Yong Kim）
附属公司

一种新的调节因子将核小体重塑复合体招募到小鼠胚胎干细胞中的无翼整合（Wnt）信号基因启动子

杰弗里·J·金等。 生物化学杂志. .

摘要

核小体重塑和去乙酰化（NuRD）复合物是调节ESC自我更新中基本多能效基因转录所必需的。MBD3被认为是形成功能性NuRD复合体的关键因素。MBD3向甲基化启动子的招募可能需要其他先决条件。我们表明，细胞周期素依赖性激酶2相关蛋白1（CDK2AP1）是早期胚胎发育的一个重要基因，通过将MBD3与Wnt信号基因的启动子区结合，在ESC的多能性中发挥作用。在缺乏CDK2AP1的情况下，MBD3在Wnt基因的几个启动子上的占有率显著降低，导致Wnt的过度激活。我们认为，NuRD介导的Wnt通路的转录调控需要必要的辅助成分，如CDK2AP1，这可能有助于复合物与靶启动子的特定焦区的关联。

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数字

图1。
图1。
删除Cdk2ap1型导致mESCs的整体甲基组学和转录组学变化。 一，维恩图显示了WT中显著甲基化的基因数量与Cdk2ap1−/−WT中有7864个甲基化基因（WT特有1525个）。有7725个甲基化基因Cdk2ap1型−/−（1386独特于Cdk2ap1型−/−). 6639个基因在WT和Cdk2ap1型−/−.b条、WT的聚类分析（单链非中心相关）和Cdk2ap1型−/−DNA甲基化阵列。删除Cdk2ap1型导致一组基因的低甲基化(上部面板)和其他一组基因的超甲基化(下部面板).c（c）CpG岛通常位于启动子区（TSS的−2500 bp）和第一外显子（TSS到100）。所示为WT和WT的所有差异甲基化基因的甲基化强度Cdk2ap1型−/−根据各自的基因组位置。d日对差异甲基化基因的DAVID分析显示了六种静态显著的通路、疾病和生物过程，其中WNT信号通路最为显著。电子、网络模块之间的关系和Cdk2ap1型特点。上部面板，14个模块的树状图。树叶沿着分支表示探针。下部树叶指示该模块中探针表达谱的更大相似性。下部面板（模块块），不同颜色的块代表14个模块。下部面板（两个相关带），WT和Cdk2ap1型−/−波段显示相关性(科尔。)到相应的模块。积极的(红色)和负片(绿色).（f），颜色打开x个轴和年轴表示网络中的14个模块。对于每个模块，热图显示模块特征基因(我)与性状的相关性。比例尺(下右)显示了正相关的可能范围(红色)到负(绿色)两个模块之间。克，与缺失显著相关的两个模块特征基因的热图Cdk2ap1型Bonferroni校正后（蓝色和绿松石模块）。观察到的负相关性蓝色模块（6908个已知基因）表明随着缺失Cdk2ap1型相反，绿松石（7883个已知基因）的正相关表明其成员的上调与缺失Cdk2ap1.h型DAVID对与Cdk2ap1型揭示了七种静态重要的途径、疾病和生物过程。我、DNA甲基化和基因表达比较。x个轴表示对数2褶皱变化的(Cdk2ap1型−/−/重量）。年轴表示Z得分（阳性，高甲基化；阴性得分，低甲基化）。这个蓝色和红色绘制的基因具有匹配的DNA甲基化模式和基因表达（51%）。
图2。
图2。
删除Cdk2ap1型导致Wnt信号通路中DNA甲基化和基因表达的改变。 一，相关的基因本体类别丰富了蓝色模块和绿松石模块。财政部。，转录因子。b条，显示了前1000个连接绿松石模块。第2r5c页,Cacybp公司、和Fzd7公司与模块特征基因值（模块内枢纽）相关性最高的是以较大尺寸显示的名称。c（c），显示了前1000个连接蓝色模块。Nfat5型,Vangl2号机组,抄送3,凸轮2a,Csnk2a1型、和Fbxw11层与模块特征基因值（模块内枢纽）相关性最高的是以较大尺寸显示的名称。d日35个Wnt基因启动子（WT）DNA甲基化模式的聚类分析相对于Cdk2ap1−/−)x个axis代表从−2500 bp到2500 bp的基因组位置。大多数差异甲基化区域在红色方框。年轴列在补充表S4.
图3。
图3。
核小体重构复合物改变后转录组变化的生物信息学分析Cdk2ap1型−/−. 一，WGCNA对mESCs中核小体重塑复合物缺失后转录组变化的聚类分析。b条，热图表示RNA聚合酶II的变化(波尔二世)Wnt基因因基因敲除而占据百万美元3单位为mESCs。CDK2AP1也影响这些Wnt基因（如图2所示d日). 热图上表示的是每个基因的−4000 bp到4000 bp。c（c），RNA聚合酶II平均占有率b.天，DAVID分析与基因簇相关的途径兆比特3击倒。发动机控制模块，细胞外基质。电子，受缺失影响的Wnt基因的文氏图Cdk2ap1型和/或击倒Mbd3.最小值，最小值；马克斯，最大值；大道，平均。
图4。
图4。
删除Cdk2ap1型导致Wnt信号通路的放松管制。 一，p-β-catenin免疫荧光显微镜（Y489）(红色)和总β-连环蛋白(绿色)英寸Cdk2ap1型+/+和Cdk2ap1型−/−mESC。Y489（p-β-catenin）和总β-catening的Western blotting分析。C类，细胞质分数；n个，核分数。Western blotting图像被量化并进行统计分析。b条Y489的免疫荧光显微镜(红色)慢病毒转导控制(低压)和慢病毒-Cdk2ap1型转导的Cdk2ap1型−/−mESC。WT、阴性对照（−）、慢病毒转导控制中Y489、总β-catenin和Cdk2ap1的Western blotting分析(低压)和慢病毒-Cdk2ap1型转导的Cdk2ap1型−/−mESC。Western blotting图像被量化并进行统计分析。c（c）AXIN1、c-Myc、p-GSK3β（Y216）和GSK3。TCF/LEF荧光素酶报告子分析以测量Wnt通路的活性。pCMV病毒-雷尼利亚同时作为对照转染。TCF/LEF分析显示1.75倍的诱导作用Cdk2ap1型−/−mESCs与WT相比。d日，Wnt信号被激活10 m米氯化锂。Y489的免疫荧光显微镜(红色)和总β-连环蛋白(绿色).上两排，重量。下面两行,Cdk2ap1型−/−.电子，免疫荧光显微镜检查APCCdk2ap1型+/+和Cdk2ap1型−/−mESC。
图5。
图5。
CDK2AP1是NuRD复合体的关键部分Cdk2ap1型导致MBD3-NuRD复合物与Wnt基因启动子的结合能力下降。 一，CDK2AP1和MBD3之间的免疫共沉淀。上部面板，带有αCDK2AP1的IP显示MBD3的特定下拉。下部面板，带有αMBD3的IP显示CDK2AP1的下拉。b条CDK2AP1-MBD3结合突变体的创建和联合IP。左侧和中间面板，使用GST标记的WTCdk2ap1型和结合突变体，在体外结合分析显示在WT、7–115、1–15、1–35、1–55、1–75、1–95、1–103和1–111中结合。62-115、85-115和96-115突变体失去相互作用。右侧面板，使用GST标记的WT兆比特3而结合突变体，检测显示只有81-291个突变体失去了结合。c（c）WT和WT中八个Wnt基因启动子区MBD3的ChIP分析Cdk2ap1型−/−.年轴呈现基于MBD3/IgG的褶皱富集。使用阳性PCR对照（PPC）作为对照。d日对WT mESCs中42个Wnt基因启动子区的CDK2AP1和MBD3进行ChIP分析。年轴显示基于Mbd3/IgG的褶皱富集。阳性PCR对照（PPC）用作对照。电子，Y489的免疫荧光显微镜(红色)和总β-连环蛋白(绿色)在慢病毒转导控制（载体）中，慢病毒-cdk2ap1转导（+WTCdk2ap1型)和LV-Cdk2ap1型-转导的Mbd3结合突变体（+Mbd3Δ）Cdk2ap1型−/−mESC。（f）中Wnt基因启动子区MBD3的ChIP分析Cdk2ap1型−/−和Cdk2ap1型恢复Cdk2ap1型−/−mESC。工作分解结构，Western blot。
图6。
图6。
Wnt表达式数组确认在Cdk2ap1型−/−mESCs和标识Wnt3a型,亚太区和c-myc公司作为的首要目标Cdk2ap1型-介导Wnt激活。 一，使用WT和Cdk2ap1型−/−mESC。这个x个轴表示的褶皱变化Cdk2ap1型−/−/WT和年轴表示第页值。12个静态显著基因显示在红色.b，12个基因在Cdk2ap1型−/−基于显著性的mESCs第页此处列出了值和折叠变化。x个轴表示基因名称和年轴表示基于Cdk2ap1型−/−超过WT。c（c），显示WT聚类分析的热图，Cdk2ap1型−/−、恢复控制、WTCdk2ap1型恢复，以及Cdk2ap1型(兆比特3Δ）恢复。在84个Wnt基因中，前8个基因可以通过野生型的异位表达恢复到WT水平Cdk2ap1型，但不是通过控制或突变Cdk2ap1型(兆比特3Δ）英寸Cdk2ap1型−/−mESC扩展到热图的右侧。d日10个Wnt基因启动子区CDK2AP1和MBD3的ChIP分析，这些启动子区在WT和Cdk2ap1型−/−mESC。年轴呈现基于MBD3/IgG的褶皱富集。PPC用作控件。分钟，最小值；大道，平均值；马克斯，最大值。
图7。
图7。
击倒亚太区通过siRNACdk2ap1型−/−mESCs恢复差异能力。 一，通过敲除siRNA实验亚太区在里面Cdk2ap1型−/−mESC。左侧面板,Cdk2ap1型−/−mESC保持不变(Undiff公司。)即使在去除LIF后（97%的未分化干细胞）。中间面板,Cdk2ap1型−/−即使用对照siRNA（92%未分化干细胞）去除LIF后，mESCs仍保持未分化状态。右侧面板,Cdk2ap1型−/−mESCs分化为类胚体(EB（电子制动系统）)LIF移除后亚太区siRNA（97%类胚体）。b条，10月4日免疫荧光显微镜(红色)英寸Cdk2ap1型−/−带和不带mESC亚太区小干扰RNA。德克萨斯州，转染。c（c），定量PCR显示10月4日在里面亚太区与WT和对照siRNA相比，siRNA敲除。d日Apc的免疫荧光显微镜检查(绿色)和Y489(红色)英寸Cdk2ap1型−/−带和不带mESC亚太区小干扰RNA。Apc蛋白表达和Y489蛋白表达随着亚太区siRNA输入Cdk2ap1型−/−mESC。电子，qPCR显示亚太区在里面亚太区与WT和对照siRNA相比，siRNA敲除。
图8。
图8。
全球背景下与Cdk2ap1相关的NuRD、分化和Wnt。完整的mESC元网络图，解释核小体重塑、分化和Wnt信号通路如何与CDK2AP1相互关联。
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