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.2012年12月；32(24):5103-15.
doi:10.1128/MCB.00820-12。 Epub 2012年10月15日。

视黄醇结合蛋白4通过NADPH氧化酶和核因子κB依赖性和视黄醇非依赖性机制诱导人内皮细胞炎症

Krysten M Farjo公司 1, 拉斐尔·法尔霍, 斯泰西·哈尔西, 吉纳迪·莫西耶夫, 马建兴
附属公司

视黄醇结合蛋白4通过NADPH氧化酶和核因子κB依赖性和视黄醇非依赖性机制诱导人内皮细胞炎症

Krysten M Farjo公司等。 分子细胞生物学. 2012年12月.

摘要

血清视黄醇结合蛋白4（RBP4）是血液中唯一的特异性维生素A（视黄醇）转运蛋白。患者血清RBP4升高与心血管疾病和糖尿病视网膜病变有关。然而，RBP4升高在这些血管疾病发病机制中的意义尚不清楚。在此，我们发现，RBP4通过刺激参与白细胞募集和内皮粘附的促炎分子的表达，包括血管细胞粘附分子1（VCAM-1），诱导原代人视网膜毛细血管内皮细胞（HRCEC）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的炎症反应，细胞间黏附分子1（ICAM-1）、E-选择素、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）和白细胞介素-6（IL-6）。我们证明，RBP4的这些新作用独立于视黄醇和RBP4膜受体STRA6，并部分通过NADPH氧化酶和NF-κB的激活而发生。重要的是，在HRCEC和HUVEC中，无视黄醇RBP4（apo-RBP4）在诱导促炎分子方面与视黄醇结合RBP4一样有效。这些研究表明，RBP4升高可直接导致内皮炎症，因此可能在心血管疾病和糖尿病微血管并发症期间血管炎症的发展或进展中起到致病作用。

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数字

图1
图1
RBP4以剂量依赖性方式诱导人内皮细胞中促炎细胞粘附分子和单核细胞趋化蛋白-1的表达。（A） 纯化重组人holo-RBP4的代表性考马斯蓝染色和Western blot分析（每车道1μg）。车道1，考马斯蓝染色凝胶；通道2，用RBP4抗体进行Western blot。（B） 纯化的重组holo-RBP4的紫外光谱分析表明，视黄醇/RBP4的比率约为0.9，表明纯化的RBP4大部分由holo-RBP 4组成。（C至F）定量RT-PCR分析VCAM-1、ICAM-1、E-selectin和MCP-1在人视网膜毛细血管内皮细胞（HRCEC）中的mRNA表达，HRCEC用浓度增加的holo-RBP4（10至100μg/ml）或BSA处理或不处理（Unt.）。与BSA治疗相比有显著差异：*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）通过Tukey事后检验的单向方差分析（ANOVA）得出<0.001。
图2
图2
RBP4以剂量和时间依赖性的方式增加HRCEC中促炎分子的细胞和细胞外蛋白水平。（A至C）经BSA处理或增加RBP4浓度24小时后的HRCEC中VCAM-1（A）、E-selectin（B）和ICAM-1（C基于ELISA的HRCEC培养基中sVCAM-1（G）、E-selectin（H）、sICAM-1（I）和MCP-1（J）的可溶性细胞外水平的定量，在用增加浓度的holo-RBP4或BSA治疗或不治疗（Unt.）后进行。用100μg/ml的holo-RBP4处理HRCEC培养基后，以（K到N）ELISA为基础定量HRCEC介质中sVCAM-1（K）、E-selectin（L）、sICAM-1（M）和MCP-1（N）的可溶性细胞外水平，所示时间为0到48小时。与BSA处理相比，显著差异：*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）通过Tukey事后检验的单向方差分析得出<0.001。
图3
图3
RBP4增加白细胞与人内皮细胞的粘附。用holo-RBP4（100μg/ml）、BSA或TNF-α（100 ng/ml）处理HRCEC的汇合单层18 h。然后添加THP-1单核细胞并共培养3 h。粘附的单核细胞在HRCEC层上方呈明亮的圆形小体。（B） 在放大×20倍的条件下，计数每个视野中的粘附单核细胞。该图显示了每个治疗组4个不同视野的平均值±标准差（TNF-α阳性对照组的粘附白细胞为205±25个视野）。***，P（P）通过Tukey事后检验进行单向方差分析，与BSA治疗相比<0.001。未经处理的细胞。
图4
图4
RBP4在HRCEC中激活NF-κB并至少部分通过NF-κB依赖性机制刺激促炎蛋白表达。（A） holo-RBP4（100μg/ml）、BSA或TNF-α治疗12 h后，用免疫细胞化学方法检测HRCEC中NF-κB p65的核转位；未经处理的未经处理细胞。（B） NF-κB p65的相对核转录活性使用基于ELISA的TransAM NFκB分析进行量化。用BSA或holo-RBP4（100μg/ml）处理HRCEC 6h，制备并分析核提取物。β-肌动蛋白、GAPDH和纤维蛋白的蛋白质印迹证明了核提取物制剂的富集和质量。C巷，胞质提取物；通道N，核提取物（10μg蛋白质/通道）。（C） 用BSA或holo-RBP4（100μg/ml）处理HRCEC 24 h，通过Western blotting和带密度分析定量Ser536处NF-κB p65的磷酸化。（D至I）HRCEC用NF-κB抑制剂PDTC（100或500μM）或JSH-23（10或50μM）预处理2 h，然后在没有或存在PDTC（D）或JSH 23（E）的情况下，在用RBP4治疗后，以100μg/ml的浓度加入holo-RBP4，持续24 h（D至E）。基于ELISA的HRCEC培养基中可溶性细胞外水平sVCAM-1（F）、sICAM-1（G）、MCP-1（H）和E-选择素（I）的定量（F至I）。与单独RBP4治疗相比，存在显著差异：*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）通过Tukey事后检验的单向方差分析得出<0.001。与BSA治疗相比有显著差异（B组和C组）：†，P（P）<0.01（按学生）t吨测试。
图5
图5
在HRCEC中，RBP4通过NADPH氧化酶依赖机制激活NADPH氧化酶蛋白表达并刺激炎症前蛋白表达。用BSA或增加holo-RBP4浓度处理（A和B）HRCEC 24 h，用Western blotting分析细胞裂解物中的Nox2（A）和Nox4（B）。（C到H）HRCEC用NADPH氧化酶抑制剂DPI（20μM）或apocynin（500或1000μM）预处理2 H，然后以100μg/ml的浓度添加holo-RBP4，持续24 H。（C和D）VCAM-1的蛋白印迹，在没有或存在DPI（C）或apocynin（D）的情况下用RBP4处理。基于ELISA的HRCEC培养基中可溶性细胞外sVCAM-1（E）、sICAM-1（F）、MCP-1（G）和E-selectin（H）水平的定量（E到H）。与单独RBP4治疗相比，存在显著差异：*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）通过Tukey事后检验的单向方差分析得出<0.001。
图6
图6
RBP4介导的NF-κB、NADPH氧化酶和促炎分子的活化与视黄醇无关。（A） 用RBP4（100μg/ml）或BSA治疗24小时或不治疗24小时后，定量RT-PCR分析HRCEC中STRA6 mRNA的表达。STRA6 mRNA的表达与HPRT看家基因的表达相关，其丰度比HPRT低20倍。（B） 通过HRCEC的蛋白质印迹检测不到STRA6蛋白的表达。稳定表达STRA6的HEK-293A细胞也作为阳性对照进行分析。（C） 用holo-RBP4（100μg/ml）或等摩尔量（4.75μM）的视黄醇、视网膜或视黄酸治疗后HRCEC细胞内视黄醇含量。HRCEC没有从holo-RBP4中摄取大量视黄醇。用增加浓度的apo-RBP4处理24小时后，HRCEC中VCAM-1和Nox2（D）或Nox4（E）的（D和E）蛋白印迹。（F）HRCEC用BSA或apo-RBP4（100μg/ml）处理24小时，通过蛋白印迹和带密度分析定量Ser536处NF-κB p65的磷酸化。（G至J）基于ELISA的定量MCP-1（G）、sVCAM-1（H）、sICAM-1（I）和E-选择素（J）在治疗24小时后的HRCEC培养基中的可溶性细胞外水平，如图所示，apo-或holo-RBP4的浓度增加。与BSA治疗相比有显著差异：*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）通过Tukey事后检验的单向方差分析得出<0.001。
图7
图7
RBP4在人脐静脉内皮细胞中诱导NF-κB、NADPH氧化酶和促炎分子。如图所示，用载脂蛋白或完整-RBP4浓度增加的处理24小时后，基于（A至C）ELISA的HUVEC培养基中可溶性细胞外水平sVCAM-1（A）、sICAM-1（B）和MCP-1（C）的定量。（D） 用增加浓度的holo-RBP4处理24小时后，HUVEC中E-selectin和Nox2、VCAM-1和Nox4的蛋白印迹。（F） 用BSA或apo-RBP4（100μg/ml）处理HUVEC 24 h，并通过Western blotting和带密度分析定量Ser536处NF-κB p65的磷酸化。与BSA治疗相比有显著差异：*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）通过Tukey事后检验的单向方差分析得出<0.001；†，P（P）<0.01（按学生）t吨测试。
图8
图8
RBP4介导的HUVEC炎症前蛋白的诱导是通过NADPH氧化酶和NF-κB的激活实现的。（A至C）HUVEC在以100μg/ml的浓度添加holo-RBP4 24 h之前，用NF-κB抑制剂PDTC（100或500μM）或JSH-23（10或50μM），或NADPH氧化酶抑制剂DPI（20μM）或者apocynin（500或1000μM）预处理2 h。以ELISA为基础定量可溶性细胞外水平的sICAM-1（A）、sVCAM-1（B），HUVEC培养基中的MCP-1（C）。与单独RBP4治疗相比，存在显著差异：*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）通过单向方差分析<0.001；†，P（P）<0.01（按学生）t吨测试。在有或无PDTC（D）或DPI（E）的情况下，RBP4治疗后HUVEC中VCAM-1的（D和E）蛋白印迹。
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