跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2012;8（10）：e1002966。
doi:10.1371/journal.pgen.1002966。 Epub 2012年10月4日。

Srrm4基因突变导致Bronx waltzer小鼠选择性剪接缺陷和耳聋

中野洋子 1, 伊斯拉特·贾汉, 格雷戈里·邦德, 孙兴申, 迈克尔·希尔德布兰德, 约翰·恩格哈特, 理查德·J·H·史密斯, 罗伯特·A·康奈尔, 伯恩德·弗里茨施, 博通·班菲
附属公司

Srrm4基因突变导致Bronx waltzer小鼠选择性剪接缺陷和耳聋

中野洋子等。 公共科学图书馆-基因. 2012.

摘要

感觉毛细胞对听力和平衡至关重要。它们从上皮前体发育而来，在转录调控方面有广泛的特征，但在转录后影响方面没有。在这里，我们报道了一种替代性剪接调控因子的鉴定和功能表征，该调控因子的失活是导致自发突变Bronx waltzer（bv）小鼠毛细胞发育缺陷、耳聋和平衡受损的原因。我们使用定位克隆和转基因拯救来定位剪接因子编码基因Ser/Arg重复矩阵4（Srrm4）的bv突变。对胚胎内耳感觉贴片中前信使核糖核酸剪接的转录组范围分析显示，在bv小鼠中，特定的替代外显子以异常高的比率被跳过。异源表达系统中的小基因实验证实，这些跳过的外显子需要Srrm4才能包含到成熟的mRNA中。序列分析和突变实验表明，受影响的转录物共享一个新的基序，这是Srrm4-依赖的选择性剪接所必需的。功能注释和蛋白质相互作用数据表明，编码的蛋白质聚集在分泌和神经传递途径中。此外，一些转录调控因子的剪接被发现是Srrm4依赖性的，已知这些调控因子靶向的几个基因在bv小鼠中的表达水平降低。虽然在神经组织和毛细胞中检测到Srrm4的表达，但对bv小鼠小脑和新皮质的分析未能检测到剪接缺陷。我们的数据表明，Srrm4功能对听力和平衡器官至关重要，但并非对所有神经组织都至关重要。Srrm4是第一个与听力相关的替代性分裂调节因子，对bv小鼠的分析为毛细胞发育提供了外显子水平的见解。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。中的缺失突变序号4bv小鼠基因。
（A） 所选候选基因在4兆碱基对（Mbp）区间的基因组位置示意图bv型已绘制突变图。（B） 左：基于RT-PCR的内耳异常短Srrm4转录物检测bv/bv鼠标。右：野生型（WT）和bv Srrm4转录物的示意图，显示RT-PCR引物（箭头）的位置、翻译和非翻译区域（分别为黑色和白色方框）以及bv/bv鼠标（灰色框）。（C） 比较序号4野生型和bv/bv老鼠。水平线代表内含子，黑色和白色方框分别代表外显子的编码区和非编码区。这个序号4的基因bv/bv小鼠缺少最后一个内含子和外显子的部分。色谱图突出了WT和bv/bv老鼠与序号4缺失位点附近的序列（从下部色谱的垂直线开始）。（D） Srrm4蛋白的示意图。括号表示由最后一个编码的蛋白质部分序号4野生型小鼠的外显子bv/bv老鼠。还显示了富含Ser/Arg（SR）的区域、推测的核定位信号（NLS）以及Srrm4与其最近的副logue（Srrm3）之间高度保守的区域（Srrm 4中的氨基酸478-525）（红色）。（E） 上面板：转染HEK293细胞和前庭黄斑区（vm）Srrm4表达的免疫印迹分析bv/bv和+/+E16.5上的小鼠。如面板所示，HEK293细胞被Srrm4转染重量，序号4bv型或空表达式向量。下面板：所有样品中的拉明B1信号显示了可比较的蛋白质负荷。箭头和数字（单位：kDa）表示MW标准的位置。
图2
图2。现场用反义Srrm4探针杂交小鼠内耳。
（A） 整体安装就地内耳杂交显示每个平衡器官中Srrm4的检测(即壶腹嵴、球囊和胞囊）、皮质器官（OC）和螺旋神经节（SG）。（B） 在耳蜗中，反义Srrm4探针标记了所有三排OHC、一排IHC和螺旋神经节（SG）。（C） 在椭圆黄斑区，Srrm4信号贯穿始终，但在中央较弱(即条纹状）区域，而不是边缘。虚线表示条纹的估计中心。（D） 在amupllaris嵴中，感觉细胞层存在Srrm4信号。显示前嵴（A）和外侧嵴（L）。星号表示前嵴的未染色、无感觉的中隔十字韧带。图中还显示了椭圆黄斑的邻近部分。比例尺：100µm。
图3
图3。bv表型通过毛细胞靶向表达序号4转基因。
（A） 的示意图序号4为救援实验设计的转基因（Tg）。它由一只老鼠组成Myo7a公司启动子、Srrm4编码序列和聚腺苷酸化（pA）位点。（B） 典型ABR波形bv型/+,bv/bv、和序号4-转基因bv/bv老鼠(bv/bv:Tg公司). 在指定的声压级（SPL）应用宽带点击刺激。（C） ABR阈值的统计分析bv型/+,bv/bv、和序号4-转基因bv/bv老鼠；每个符号表示单个鼠标的值（单向方差分析，P（P）<0.0001，事后Tukey测试：*P（P）<0.01）。（D） 坠落前在固定水平杆上花费的时间bv型/+,bv/bv、和序号4-转基因bv/bvP70–80的小鼠。试验的最长持续时间为60 s（单向方差分析，P（P）<0.0001，事后Tukey测试：*P（P）<0.01）。（E） 前庭黄斑准备bv型/+,bv/bv公司、和序号4-转基因bv/bv小鼠（P5）用指骨肽-Alexa Fluor 488染色，以可视化富含肌动蛋白的结构，包括静纤毛。（F） Corti制剂的中期器官bv型/+,bv/bv、和序号4-转基因bv/bv公司用抗Myo7a抗体染色的小鼠（P5），该抗体专门标记IHC（箭头）和OHC（括号）。只有IHC行受bv型突变。比例尺：50µm。
图4
图4。bv/bv公司小鼠内耳有拼接缺陷，但小脑没有。
（A） 分析前庭黄斑区前mRNA剪接的工作流程示意图bv/bv和bv型/+老鼠。通过激光捕获显微切割（LCM）分离前庭黄斑，并使用小鼠外显子连接微阵列（MJAYs）分析捕获组织中的RNA样本。（B） 盒式外显子MJAY探针组的设计。通常，4个MJAY探针组（黑盒）用于测量一个盒外显子的拼接（红盒）；探针对盒外显子本身、上游和下游外显子-外显子连接以及跳跃连接进行退火。（C） 归一化探针信号的微阵列热图。探针组信号显示，每个可选外显子至少有两个探针组（通过括号连接）导致对前庭黄斑区剪接率的评估存在显著差异bv型/+和bv/bv老鼠。左边的点表示外显子跳跃探针组生成的数据。（D） RT-PCR验证前庭黄斑区8种剪接差异bv型/+和bv/bv小鼠（其他RT-PCR数据如图S5所示）。RT-PCR引物被设计成退火到构成外显子（白盒），位于被测替代外显子的两侧（红盒）。（E） 归一化探针强度比(我 规范)来自前庭黄斑bv公司/+和bv/bv老鼠被密谋与来自小脑的老鼠对抗bv型/+和bv/bv老鼠。只有指示前庭黄斑区拼接差异的探针组才包括在图中（皮尔逊相关检验，对 = 0.1,P（P） = 0.3). （F） RT-PCR证实bv/bv小鼠缺乏在同一小鼠系的前庭黄斑中观察到的剪接缺陷。
图5
图5。Srrm4依赖性剪接需要Srrm4C末端区域和前mRNA中的新基序。
（A） 基于RT-PCR的HEK293细胞选择性剪接检测与Srrm4-编码结构（Srrm4重量，序号4bv型或空表达载体）以及由外显子和内含子组成的小基因（图）。每个小基因都包含一个替代外显子（红盒）和相邻的内含子序列，这些序列位于两个组成型外显子（白盒）之间。指出了小基因的启动子和多聚腺苷酸化位点（pA）。箭头指示RT-PCR引物的位置。显示了4个小基因编码mRNA的RT-PCR结果。注射zSrrm4 MO、MO不敏感zSrrm 4不同组合的斑马鱼（B–E）毛细胞存活率重量mRNA和MO不敏感zSrrm4bv型mRNA，如图所示。上面的面板显示了每个治疗组斑马鱼（72 hpf）的典型亮场图像。在用FM1–43染料（强绿色信号）可视化毛细胞后，下部面板显示了每个治疗组的神经肥大的代表性荧光图像。细胞-细胞连接处微弱的绿色信号是由于斑马鱼神经肥大细胞膜锚定GFP的转基因表达。比例尺：200µm。（F） Srrm4调节外显子上游的一致序列模体的序列缺失表示。检测到的共有基序包括一个聚嘧啶域、一个UGC基序和一个AG基序。（G） 转染Ergic3小基因野生型（WT）或突变型（M1-4）版本以及Srrm4的HEK293细胞选择性剪接的RT-PCR测试结果重量（+）或空表达式向量（−），如图所示。图中显示了WT和突变序列（M1–4）。突变碱基以粗体显示。（H） 使用生物素化RNA寡核苷酸或控制空链霉亲和素珠（−），RNA从转染HEK293细胞的全细胞裂解物（裂解物）中拉下标记的Srrm4。野生型RNA寡核苷酸（WT）序列包含来自Srrm4调节外显子之前内含子的35个核苷酸和来自外显子的5个核苷酸。内含子和外显子之间的边界用连字符表示。在突变的RNA寡核苷酸（M）中，GC基序被AU（粗体字符）取代。使用抗flag抗体和Western印迹法评估细胞裂解物和洗涤珠上flag-Srrm4的量。
图6
图6。图示由验证的Srrm4-regulated mRNA编码的蛋白质的已知和预测亚细胞定位。
Srrm4-依赖性剪接的验证mRNA靶点编码的蛋白质以蓝色显示。蛋白质定位和相互作用数据的参考见表S3。对于Srrm4-regulated mRNAs编码的8种蛋白质，亚细胞定位要么位于描述区域之外，要么未知。已知不受Srrm4调节但将Srrm4-regulated蛋白质相互连接或膜连接的蛋白质显示为绿色。箭头指示每个传输事件的方向。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Dallos P（2008），耳蜗放大，外毛细胞和prestin。《神经生理学杂志》18:370-376。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Géléoc GS，Holt JR（2003），小鼠内耳毛细胞感觉转导的发育获得。《国家神经科学》6:1019–1020。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Lelli A，Asai Y，Forge A，Holt JR，Géléoc GS（2009）小鼠耳蜗外毛细胞感觉转导发育获取中的Tonotopic梯度。神经生理学杂志101:2961–2973。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Frolenkov GI、Belyantseva IA、Friedman TB、Griffith AJ（2004）《内耳毛细胞形态发生的遗传学见解》。Nat Rev Genet 5:489–498。-公共医学
    1. Richardson GP、de Monvel JB、Petit C（2011）《耳聋遗传学如何阐明听觉生理学》。《生理学年鉴》73:311–334。-公共医学

出版物类型

MeSH术语