Overexpressed FATP1, ACSVL4/FATP4 and ACSL1 increase the cellular fatty acid uptake of 3T3-L1 adipocytes but are localized on intracellular membranes

doi:10.1371/journal.pone.0045087

.2012;7（9）：e45087。

doi:10.1371/journal.pone.0045087。 Epub 2012年9月14日。

过度表达的FATP1、ACSVL4/FATP4和ACSL1增加3T3-L1脂肪细胞的细胞脂肪酸摄取，但局限于细胞内膜

天作湛¹, 玛格丽特·波佩勒（Margarete Poppelreuther）, 罗伯特·埃赫霍尔特, 约阿希姆·福勒克鲁格

附属公司

PMID： 23024797
预防性维修识别码：项目经理3443241
内政部： 10.1371/journal.pone.0045087

过度表达的FATP1、ACSVL4/FATP4和ACSL1增加3T3-L1脂肪细胞的细胞脂肪酸摄取，但局限于细胞内膜

天作湛等。公共科学图书馆一号. 2012.

.2012;7（9）：e45087。

doi:10.1371/journal.pone.0045087。 Epub 2012年9月14日。

作者

天作湛¹, 玛格丽特·波佩勒（Margarete Poppelreuther）, 罗伯特·埃赫霍尔特, 约阿希姆·福勒克鲁格

附属

¹德国海德堡海德堡大学内科IV分子细胞生物学实验室。

PMID： 23024797
预防性维修识别码：项目经理3443241
内政部： 10.1371/journal.pone.0045087

摘要

长链酰基辅酶A合成酶是脂质代谢的必需酶，也与脂肪酸的细胞摄取有关。如果这些酶的部分或全部在质膜上作为脂肪酸转运蛋白具有额外功能，则存在争议。脂肪细胞中最丰富的酰基辅酶A合成酶是FATP1、ACSVL4/FATP4和ACSL1。先前的研究表明，它们通过直接跨膜转运增加脂肪酸的吸收。在这里，我们采用获得功能的方法，通过逆转录病毒转导建立了稳定表达3T3-L1脂肪细胞的FATP1、ACSVL4/FATP4和ACSL1。所有过度表达的细胞株都显示出酰基辅酶A合成酶活性和脂肪酸摄取增加。通过共焦显微镜和亚细胞分离，FATP1和ACSVL4/FATP4定位于内质网，而ACSL1定位于线粒体。胰岛素增加脂肪酸摄取，但不改变FATP1或ACSVL4/FATP4的定位。我们得出结论，过表达的酰基辅酶A合成酶能够促进3T3-L1脂肪细胞中脂肪酸的摄取。FATP1、ACSVL4/FATP4和ACSL1的细胞内定位表明这是一种间接作用。我们认为代谢捕获是酰基辅酶A合成酶影响细胞脂肪酸摄取的机制。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。3T3-L1脂肪细胞中FATP1和ACSVL4/FATP4表达的特征。**
（A）通过与一般转录因子2b（Gtf2b）相关的效率校正定量实时PCR，定量FATP1和ACSVL4/FATP4 mRNA在过度表达（3T3-FATP1，深灰色和3T3-FATP4，浅灰色）和控制脂肪细胞（3T3-RJ，白色条）中的水平。在3T3-FATP1中，FATP1 mRNA水平相对增加3.5倍（n = 2）在3T3-FATP4中，ACSVL4/FATP4 mRNA水平增加了6.9倍（n = 1）与3T3-pRJ相比。（B，C，D）通过对FATP1、ACSVL4/FATP4和ACSL1-FLAG过度表达和控制脂肪细胞的总细胞裂解物进行蛋白质印迹分析。密度测定显示FATP1（n）过度表达11倍 = 1） ACSVL4/FATP4的9.0倍过表达（n = 2).

**图2。FATP1和ACSVL4/FATP4定位于3T3-L1脂肪细胞的内质网。**
（A–D）FATP1细胞内定位的比较分析。FATP1（绿色：A，B+D/红色：C；亲和纯化兔抗FATP1）与质膜标记物CD36（A）（红色，小鼠多克隆抗CD36）或线粒体标记物鸟氨酸氨甲酰转移酶（C）（绿色，OCT-GFP；C末端与GFP偶联，通过核感染表达）不重叠。FATP1（绿色）与ER标记Sec61β（红色；C末端与RFP结合，通过核感染表达）在脂肪细胞（B）和成纤维细胞（D）中共同定位，如重叠图像中的黄色所示。脂肪细胞中有一个明显的区域被FATP1覆盖，而不是ER（B）。显示了来自单个共焦截面的代表性图像，所有图像的尺寸条均为10µm。（E–H）ACSVL4/FATP4细胞内定位的比较分析。ACSVL4/FATP4（绿色：E，F+H/红色：G）；亲和纯化兔抗FATP4）不能与CD36（E）（红色）或Tom20（G）（绿色）共定位。脂肪细胞（F）和成纤维细胞（H）中ACSVL4/FATP4（绿色）与Sec61β-RFP（红色）重叠。

**图3。ACSL1-FLAG定位于3T3-L1脂肪细胞的线粒体。**
（A–D）FLAG标记的ACSL1细胞内定位的比较分析。（A） ACSL1-FLAG（绿色）；小鼠单克隆抗FLAG M2）不与CD36共定位。（红色）。（B–C）ASCL1-FLAG（红色）与线粒体标记物OCT-GFP的一致性对于低分化（B）非常好，但对于高分化脂肪细胞（C）则不太完整。（D）在成纤维细胞中，ACSL1-FLAG与线粒体标记物完全重叠。

**图4。FATP1、ACSVL4/FATP4和ACSL1-FLAG的过度表达增强了脂肪酸的活化和摄取。**
（A）在20µM的浓度下，从3T3-pRJ对照（白色条）、3T3-FATP1（浅灰色）、3P3-FATP4（深灰色）和3T3-ACSL1-FLAG脂肪细胞（点状）的细胞裂解液中测定10分钟的油酰基辅酶A合成酶活性[³H] -油酸盐（比活度10 Ci/mol）。*与3T3-pRJ相比p<0.05；n个 = 4.（B）通过用200µM培养脂肪细胞3 h来测量油酸盐摄取量[³H] -与100µM无脂肪酸BSA结合的油酸（比活性0.5 Ci/mol）。*与3T3-pRJ相比p<0.05；n个 = 4

**图5。短期与胰岛素孵育可增强荧光脂肪酸的吸收。**
使用或不使用1µg/ml胰岛素预处理（A+B）3T3-FATP1（深灰色条）、3T3-FAP4（浅灰色条）和3T3-RJ对照脂肪细胞（白色条）10分钟，然后与340µM[³H] -油酸与170µM无脂肪酸BSA（比活性1 Ci/mol）结合5分钟（A）或170µM[³H] -油酸与85µM不含脂肪酸的BSA（比活性1 Ci/mol）结合60分钟（B）。*p<0.05；n个 = 3.（C+D）3T3-FATP1（深灰色条）、3T3-FAT P4（浅灰色条）和3T3-RJ对照脂肪细胞（白色条）用或不用1µg/ml胰岛素预处理18分钟，然后与2µM体脂肪酸（FA）共同孵育_截至12（C）；n个 = 3/前_{截至2016年}（D）；n个 = 2）与2µM BSA结合2分钟。随后的FACS分析显示，与3T3-RJ对照脂肪细胞（白色条）相比，3T3-FATP1（深灰色条）和3T3-FAT P4（浅灰色条）经胰岛素治疗后，地理平均荧光信号的增加更为显著，但这仅限于特定的体脂肪酸种类（FA_截至12用于3T3-FATP4（C）和FA_{截至2016年}用于3T3-FATP1（D））。给出了具有代表性的实验。

**图6。短期与胰岛素孵育不会改变FATP1和ACSVL4/FATP4的细胞内定位。**
用1µg/ml胰岛素处理或不处理（A+B）3T3-FATP1和3T3-FAT P4 20分钟，用共焦激光扫描显微镜进行染色和分析定位变化。未观察到FATP1（A）或ACSVL4/FATP4（B）与质膜定位的CD36共同定位，无论是胰岛素处理的细胞还是未处理的细胞。（C）用1µg/ml胰岛素处理或未处理20分钟的野生型3T3-L1脂肪细胞的亚细胞分级。每个亚细胞组分施用20µg。胰岛素刺激后，在质膜（PM）部分中观察到GLUT4的显著增加，同时低密度（LDM）和高密度膜部分（HDM）也随之减少。FATP1和ACSVL4/FATP4没有观察到这种变化。FATP1、ACSVL4/FATP4和ER标记calnexin具有相同的分布模式。这种模式与电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1（VDAC）的分布不同，VDAC主要定位于线粒体，部分定位于质膜和质膜定位的钠钾ATP酶。显示了具有代表性的斑点。

**图7。在FATP1和ACSVL4/FATP4过度表达的脂肪细胞中，胰岛素介导的葡萄糖摄取增强。**
用1µg/ml胰岛素孵育3T3-FATP1（深灰色条）和3T3-FATP4脂肪细胞（浅灰色条）以及对照脂肪细胞（白色条）20分钟，然后用0.1 mM 2-脱氧-D-葡萄糖[DOG]，1 mCi/ml共同孵育10分钟。胰岛素处理的细胞的葡萄糖摄取量显著升高（*p<0.05）这种作用在FATP1和ACSVL4/FATP4过度表达的脂肪细胞中更为明显（*p<0.05），n = 三。

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1. Frohnert BI，Bernlohr DA（2000）《哺乳动物细胞中脂肪酸转运蛋白的调节》。脂质研究进展39:83–107。-公共医学
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[9] Kampf JP，Kleinfeld AM（2007）FFA的膜转运是由脂质、蛋白质或两者介导的吗？一种未知蛋白质介导脂肪细胞质膜上的游离脂肪酸转运。生理学（贝塞斯达）22:7–14。-公共医学

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