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.2012年11月1日;303(9):L748-57。
doi:10.1152/ajplung.00102.2012。 Epub 2012年9月14日。

TLR4缺乏促进香烟烟雾诱导的肺气肿中的自噬

附属公司

TLR4缺乏促进香烟烟雾诱导的肺气肿中的自噬

Chang Hyeok An公司等。 美国生理学杂志肺细胞分子生理学. .

摘要

Toll样受体(TLRs)在肺稳态中发挥重要的非免疫功能。TLR4缺乏会导致肺气肿。我们检测了TLR4在调节香烟烟雾(CS)诱导的自噬、凋亡和肺气肿中的作用。肺组织取自慢性阻塞性肺病(COPD)患者。将C3H/HeJ(Tlr4突变)小鼠和C57BL/10ScNJ(Tr4缺失)小鼠及其相应的对照菌株暴露于慢性CS或空气中。将人或小鼠上皮细胞(野生型、Tlr4敲低和Tlr4缺陷型)暴露于CS提取物(CSE)。通过Western blot分析或共焦成像分析样本TLR4表达和自噬或凋亡蛋白。慢性阻塞性肺病肺组织和接触CSE的人肺上皮细胞TLR4表达增加,自噬[微管相关蛋白-1轻链-3B(LC3B)]和凋亡(裂解caspase-3)标记物增加。与对照细胞相比,转染TLR4 siRNA的Beas-2B细胞在基础上和接触CSE后,LC3B表达增加。Tlr4缺乏小鼠肺泡II型细胞中LC3B和裂解caspase-3的基础和CSE诱导表达升高。长期接触CS-的野生型小鼠表现出空域扩大;,然而,CS-暴露后,与野生型小鼠相比,Tlr4突变或缺失小鼠的空气空间显著增加。在基础条件下和CS暴露后,Tlr4突变或缺失小鼠的LC3B水平较高。在暴露于CS的Tlr4缺陷小鼠中,裂解caspase-3的表达显著增加。我们描述了TLR4对CS引起的肺气肿改变的保护性调节功能。

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数字

图1。
图1。
慢性阻塞性肺病(COPD)晚期患者诱导Toll样受体4(TLR4),同时自噬蛋白轻链-3B(LC3B)和细胞凋亡增加。采用Western blot分析法分析从不吸烟者和COPD阻塞性肺病全球倡议(GOLD)2期(G2)和4期(G4)患者的肺组织(n个=5表示从不吸烟者;n个COPD GOLD 2期患者=15;n个=COPD GOLD 4期患者为15)。对TLR4和裂解半胱天冬酶-3进行Western blot分析,定量相对TLR4(A类)和裂解半胱天冬酶-3(B类)表达式。β-肌动蛋白作为标准。数据为平均值±SE*P(P)与不吸烟者相比<0.05#P(P)与前一组相比<0.05。对LC3B-II进行LC3B蛋白印迹分析(C类). β-肌动蛋白作为标准。数据为平均值±SE*P(P)与不吸烟者相比<0.05#P(P)与前一组相比<0.05。D类:人肺组织LC3B免疫组织化学染色的代表性图像。E类:TLR4(红色)和LC3B(绿色)免疫荧光染色。比例尺指示10μm。F类:免疫荧光染色TLR4(红色)和SP-C(绿色)作为II型肺泡上皮细胞的标记物。DAPI,4,6-二脒基-2-苯基吲哚。比例尺=10μm。
图2。
图2。
TLR4表达增加调节香烟提取物(CSE)处理的上皮细胞中自噬蛋白LC3B和凋亡。A类:用CSE(20%)处理Beas-2B细胞指定的时间,并通过TLR4和TLR2的蛋白质印迹分析来分析它们的细胞裂解物。β-肌动蛋白作为标准。B类:A549细胞用20%的CSE处理指定的时间,用Western blot分析其细胞裂解物TLR4和TLR2。β-肌动蛋白作为标准。C类:用CSE(10%)处理人支气管上皮(HBE)细胞指定的时间,并用Western blot分析其细胞裂解产物TLR4、LC3B和裂解caspase-3。β-肌动蛋白作为标准。D类:用CSE(20%)处理Beas-2B细胞指定的时间,并用Western blot分析其细胞裂解物的TLR4和LC3B。β-肌动蛋白作为标准。E类:用对照siRNA(CTL)或TLR4-siRNA(TLR4)预处理Beas-2B细胞48 h,然后用CSE(20%)处理6 h。然后对裂解产物进行Western blot分析,如图所示。β-肌动蛋白作为标准。F类:从C57BL/10ScNJ中分离出原代肺泡II型(ATII)细胞(Tlr4号机组-缺乏)和C57BL/10SnJ[野生型(WT)]小鼠。将ATII细胞暴露于20%的CSE中6 h,并对裂解产物进行TLR4、LC3B和裂解半胱天冬酶-3的免疫印迹。β-肌动蛋白作为标准。G公司:从C57BL/10SnJ(WT)小鼠中分离出原代ATII细胞,并在气液界面(ALI)状态下培养。ATII细胞暴露于50 mg/m3对一支香烟的总颗粒物进行10分钟的免疫印迹,并对裂解产物进行TLR4和LC3B的免疫印记。β-肌动蛋白作为标准。H(H):ATII细胞用20%的CSE处理指定时间,培养液进行乳酸脱氢酶(LDH)释放试验。数据表示平均值±SE*P(P)同一小鼠组与前一天相比<0.05#P(P)与当天野生型小鼠相比<0.05。
图3。
图3。
年暴露于CS使肺气肿加重Tlr4号机组-突变或Tlr4号机组-缺陷小鼠。A类:C3H/HeOuJ(WT)和C3H/HeJ的平均线性截距(MLI)的量化(Tlr4号机组-突变)小鼠暴露于CS 2个月。数据表示平均值±SE*P(P)与同一品系的空气暴露小鼠相比,<0.05#P(P)与具有相同暴露的WT小鼠相比,<0.05。B类:肺部的代表性图像显示为改良Gill染色。C类:C56BL/10SnJ(WT)和C56BL/10ScNJ的MLI量化(Tlr4号机组-缺陷)小鼠暴露于CS 6个月。数据表示平均值±SD*P(P)与同一品系的空气暴露小鼠相比,<0.05#P(P)与相同暴露的WT小鼠相比,<0.05。D类:肺的代表性图像用改良的吉尔染色法显示。
图4。
图4。
TLR4在体内调节CS-诱导的自噬蛋白LC3B和凋亡。C57BL/10SnJ(WT)或C57BL/10ScNJ(Tlr4号机组-缺乏)小鼠暴露于CS或空气中6个月(C57BL/10SnJ,n个=空气为6,n个=CS为5;C57BL/10ScNJ,n个=空气为5,n个=4(对于CS)。LC3B的Western blot分析及其定量(A类)和裂解半胱天冬酶-3(B类). 数据为平均值±SE*P(P)同一菌株与空气暴露组相比<0.05#P(P)与相同暴露的WT小鼠相比,<0.05。C类:小鼠肺组织中LC3B免疫组化染色的代表性图像。D类:小鼠肺组织TLR4(红色)和LC3B(绿色)免疫荧光染色。E类:TLR4(红色)和SP-C(绿色)免疫荧光染色作为小鼠肺组织中ATII细胞的标记。白色标尺=10μm;黄色比例尺=5μm。F类:肺组织匀浆的脂质过氧化[丙二醛(MDA)]测定。数据为平均值±SE*P(P)同一菌株与空气暴露组相比<0.05#P(P)与具有相同暴露的WT小鼠相比,<0.05。G公司:4-羟基-2-壬烯醛(4-HNE)(红色)的免疫荧光染色,作为小鼠肺组织脂质过氧化的标志。蓝色表示DAPI染色用于核染色。
图5。
图5。
C3H/HeOuJ(重量)或C3H/HeJ(Tlr4号机组-将突变小鼠暴露于CS或空气中2个月(C3H/HeOuJ,n个=空气为6,n个=6(对于CS);C3H/HeJ,n个=空气为5,n个=5(对于CS)。蛋白质印迹分析及其定量(A类)和免疫组织化学染色(B类)在小鼠肺中进行LC3B的检测。数据表示平均值±SE*P(P)同一菌株与空气暴露组相比<0.05#P(P)与相同暴露的WT小鼠相比,<0.05。C类:小鼠肺组织TLR4(红色)和LC3B(绿色)免疫荧光染色。D类:TLR4(红色)和SP-C(绿色)免疫荧光染色作为小鼠肺组织中ATII细胞的标记。白色标尺=10μm;黄色刻度条=5μm。

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