Divergent antiviral effects of bioflavonoids on the hepatitis C virus life cycle

doi:10.1016/j.virol.2012.08.029

.2012年11月25日；433(2):346-55.

doi:10.1016/j.virol.2012.08.029。 Epub 2012年9月11日。

生物类黄酮对丙型肝炎病毒生命周期的不同抗病毒作用

罗尼克·哈查图利安¹, 阿鲁穆加斯瓦米省, 桑塔努·雷乔杜里, 乔治·K·叶, 伊登·马洛尼, 朱莉·王, 阿西姆·达斯古普塔, Samuel W法语

附属公司

PMID： 22975673
预防性维修识别码：项目经理3478964
内政部： 2016年10月10日/j.virol.2012.08.029

生物类黄酮对丙型肝炎病毒生命周期的不同抗病毒作用

罗尼克·哈查图利安等。病毒学. 2012.

.2012年11月25日；433(2):346-55.

doi:10.1016/j.virol.2012.08.029。 Epub 2012年9月11日。

作者

罗尼克·哈查图利安¹, 阿鲁穆加斯瓦米省, 桑塔努·雷乔杜里, 乔治·K·叶, 伊登·马洛尼, 朱莉·王, 阿西姆·达斯古普塔, Samuel W法语

附属

¹美国加利福尼亚州洛杉矶加利福尼亚大学戴维·格芬医学院分子生物学研究所分子生物学跨部门博士项目。RnKhch@ucla.edu

PMID： 22975673
预防性维修识别码：项目经理3478964
内政部： 2016年10月10日/j.virol.2012.08.029

摘要

我们之前已经证明，槲皮素是一种生物类黄酮，通过抑制NS5A驱动的内部核糖体进入位点（IRES）介导的病毒基因组翻译来阻止丙型肝炎病毒（HCV）的增殖。在此，我们研究了槲皮素和其他六种生物类黄酮的抗病毒活性机制。我们证明儿茶素、柚皮素和槲皮素具有显著的抗病毒活性，没有相关的细胞毒性。这些生物类黄酮并未显著改变感染性病毒的分泌。与槲皮素相比，儿茶素和柚皮素对感染性病毒组装的抑制作用更强。槲皮素显著阻止病毒翻译，而儿茶素和柚皮素表现出温和的活性。类似地，在IRES报告基因测定中，槲皮素完全阻断NS5A增强的IRES介导的翻译，而儿茶素和柚皮素仅具有温和的作用。此外，与儿茶素和柚皮素相比，槲皮素对HSP70诱导的抑制作用不同。因此，这些生物类黄酮的抗病毒活性是通过不同的机制介导的。因此，这些生物类黄酮的组合可以协同对抗丙型肝炎病毒。

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数字

图1
生物类黄酮的分子结构。生物类黄酮分子结构改编自Sigma-Aldrich。对于柚皮素，（S）对映体的结构如图所示；然而，这种化学物质是两种对映体的外消旋混合物。水飞蓟宾是水飞蓟素的主要活性成分。

图2
MTT法测定生物类黄酮的细胞毒性**答：。**25–125μM浓度范围内的生物类黄酮细胞毒性特征。MTT测定在治疗后72小时进行。B。125μM下72小时的生物类黄酮细胞毒性曲线。所有数据均归一化为时间0。方框表示类黄酮根据相似的毒性特征组合在一起。（误差条反映标准偏差。）

图3
生物类黄酮抗病毒活性。**答：。**25μM生物类黄酮对病毒增殖的影响。Huh-7.5细胞感染了报告病毒，并立即用生物类黄酮进行处理。治疗48小时后，检测荧光素酶活性。B。生物类黄酮对Renilla活性的影响。对转染pRL-TK质粒的细胞进行荧光素酶分析。**C、。**MTT分析与A和B部分的分析平行进行。D。125μM水飞蓟素对病毒增殖的影响。用报告病毒感染Huh-7.5细胞，并用生物类黄酮处理48小时，如A部分所述，然后进行荧光素酶分析。（*、**和***分别表示P<0.05、P<0.005和P<0.0005。误差线反映标准偏差。）

图4
儿茶素、柚皮素和槲皮素的剂量依赖性抗病毒活性。**答：。**用Renilla报告病毒感染Huh-7.5细胞，立即用25-125μM浓度范围内的每种生物类黄酮处理72小时，然后测量荧光素酶活性。B。对感染图4A中细胞浓缩上清液的细胞进行荧光素酶分析。用上清液感染Huh-7.5细胞，72小时后收获。**C、。**生物类黄酮对病毒基因组水平的影响。用报告病毒感染Huh-7.5细胞，用125μM生物类黄酮处理72小时，然后进行定量反转录酶PCR。D。生物类黄酮对病毒蛋白质水平的影响。NS5A和加载对照微管蛋白的西方分析是对来自C部分的相同样品进行的（*和**分别表示P<0.05和0.005。误差条反映标准偏差。）

图5
生物类黄酮对细胞内病毒蛋白生成的影响。**答：。**用报告病毒感染Huh-7.5细胞，并立即用125μM生物类黄酮处理。20小时后，测量荧光素酶水平。B。荧光素酶分析以类似的方式进行，但在感染后的不同时间点进行。将所有值标准化为24小时时间点。（**和^†分别表示P<0.005和P<0.000005。误差线反映标准偏差）。

图6
生物类黄酮对感染性病毒分泌的影响。**答：。**感染Huh-7.5细胞，24小时后，用125μM生物类黄酮处理5小时。立即取出上清液并浓缩30倍，以去除约97%的生物类黄酮，并用于感染幼稚细胞，72小时后进行荧光素酶检测。B。对照实验，以确定浓度是否能有效去除A部分上清液中的生物类黄酮。两组huh-7.5细胞感染了报告病毒。随后，将一组细胞的上清液替换为含有125μM生物类黄酮的培养基。对于另一组细胞，过滤并浓缩含有125μM生物类黄酮的培养基，以去除生物类黄酮。然后使用清除的培养基替换培养上清液。72小时后，测定荧光素酶活性。（****和^†分别表示P<0.00005和P<0.000005。误差线反映标准偏差。）

图7
生物类黄酮对组装的影响。**答：。**立即用0.1μg/ml Brefeldin A（BFA）处理Huh-7.5细胞。31小时后，用125μM生物类黄酮处理细胞5小时，然后去除培养基并保存以供进一步分析，用PBS洗涤细胞两次以去除生物类黄酮。添加新鲜培养基，并对细胞进行三次冷冻/解冻循环。清除细胞碎片后，用上清液感染原始细胞，72小时后进行荧光素酶分析。所有数值均归一化为“DMSO+BFA”。B。对照实验，以确定生物类黄酮是否影响A部分条件下的病毒蛋白翻译。按照A部分所述，感染Huh-7.5细胞并用BFA和生物类黄酮进行处理。生物类黄酮处理5小时后，立即清洗和溶解细胞*雷尼利亚*荧光素酶测定。**C、。**对照实验，以确定在原始A部分组装测定中BFA对病毒分泌的影响。从原始培养物中保存的上清液浓缩30倍以去除生物类黄酮，并用于感染原始细胞，72小时后进行荧光素酶检测。所有数值均按二甲基亚砜处理标准化。（*、**和***分别表示P<0.05、P<0.005和P<0.0005。误差线反映标准偏差。）

图8
生物类黄酮对IRES介导翻译的影响。**答：。**用于测量IRES介导翻译的双顺反子报告结构示意图。*雷尼利亚*萤光素酶（RLuc）和*萤火虫*荧光素酶（FLuc）分别由5′帽和HCV IRES驱动。*萤火虫*到*雷尼利亚*这些比率反映了IRES介导的翻译的变化。B。生物类黄酮对IRES介导翻译的影响。293T细胞转染IRES报告体和NS5A或GFP。12小时后，用125μM生物类黄酮处理细胞，72小时后进行荧光素酶检测。**C、。**西方分析生物类黄酮对热休克后HSP70水平的影响。用125μM生物类黄酮处理Huh-7.5细胞2小时，并在42°C下进行热休克30分钟。在37°C下恢复6小时后，对细胞进行裂解，并用HSP70抗体（HSPA1A）进行Western分析。D。C组的Western blot密度测定。HSP70数量归一化为微管蛋白。（*、**和***分别表示P<0.05、P<0.005和P<0.0005。误差线反映标准偏差。）

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