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.2012年9月27日;2(3):462-9.
doi:10.1016/j.celrep.2012.08.005。 Epub 2012年8月30日。

WT1-BASP1抑制转录需要BASP1的肉豆蔻酰化和组蛋白脱乙酰酶的PIP2依赖性募集

附属公司

WT1-BASP1抑制转录需要BASP1的肉豆蔻酰化和组蛋白脱乙酰酶的PIP2依赖性募集

Eneda Toska公司等。 单元格代表. .

摘要

Wilms的肿瘤1蛋白WT1是一种转录调节因子,参与细胞生长和分化。转录辅抑制因子BASP1与WT1相互作用,将WT1从转录激活物转换为阻遏物。在这里,我们证明BASP1的N-末端肉豆蔻酰化是必需的,以诱导WT1靶基因的转录抑制。我们发现肉豆蔻酰化BASP1与核PIP2结合,导致PIP2募集到WT1依赖性靶基因的启动子区域。BASP1的肉豆蔻酰化和与PIP2的结合是BASP1与HDAC1相互作用所必需的,后者介导HDAC1向启动子的募集并引发转录抑制。我们的发现揭示了肉豆蔻酰化在转录中的作用,以及PIP2通过组蛋白脱乙酰酶的募集在基因特异性转录抑制中的关键功能。

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数字

图1
图1。BASP1的肉豆蔻酰化是其转录抑制活性所必需的
(A) BASP1示意图。N-末端20残基和肉豆蔻酰化G2如下所示,PKC位点位于S6、NLS和PEST序列。将pCDNA3单独或驱动野生型BASP1、BASP1 G2A或BASP1 S6D的表达转染到M15细胞中,48小时后用所示抗体对核(N)和细胞质(C)部分进行免疫印迹。层粘连蛋白和β-微管蛋白是核和细胞质的对照。M、 肉豆蔻酰化位点;NLS,核定位序列;P、 磷酸化位点;S、 sumoylation站点。(B) M15细胞(顶部)或U2OS细胞(底部)如(A)所示转染,用抗BASP1抗体或对照IgG进行ChIP。引物扩增WT1结合区6月B日周期素启动子用于定量PCR(qPCR),以确定相对于非编码区的折叠富集。误差线是三个独立实验的平均值(SDM)的标准偏差。(C) 如(A)所示转染M15细胞(顶部)或U2OS细胞(底部),48小时后,制备RNA和cDNA。qPCR检测GAPDH、JunB和Cyclin E mRNA。数据与GAPDH mRNA相关,误差条表示三个独立实验的SDM。(D) 将驱动BASP1表达的pCDNA3或pCDNA2与对照、NMT1或NMT2 siRNA一起转染M15细胞。48小时后制备cDNA,并进行qPCR检测GAPDH、Cyclin E和JunB mRNA。图中表示Cycline(顶部)和Jun B(底部)相对于GAPDH的表达式(误差条是三个独立实验的SDM)。下面,用所示抗体对同时制备的全细胞提取物进行免疫印迹。另请参见图S1。
图2
图2。BASP1与核电PIP2联合
(A) U2OS细胞与兔BASP1抗体和小鼠PIP2抗体共同免疫荧光。对照抗小鼠(m)和抗兔(r)抗体显示在最下面一行。(B) 如(A)所示,但共焦显微镜用于观察核BASP1和PIP2。(C) 在用BASP1或PIP2抗体进行免疫荧光之前,用2mg/ml新霉素模拟处理或处理U2OS细胞24小时。(D) HeLa核提取物用对照IgG或PIP2抗体进行免疫沉淀,样品用BASP1抗体进行免疫印迹。(E) HeLa核提取物用对照IgG或BASP1抗体进行免疫沉淀,样品用BASP1免疫印迹或用PIP2抗体斑点印迹。(F) 从稳定转染表达野生型BASP1的K562细胞中提取的核提取物与含有等量PIP2或PIP3的对照琼脂糖珠培养。清洗珠子后,用BASP1抗体对结合产物进行免疫印迹。一、 输入核提取物。另请参见图S2。
图3
图3。BASP1将PIP2招聘至推广人员限定的WT1
(A) 用表达野生型BASP1(wt)或突变衍生物G2A、S6A、mNLS(K7A:K9A)和S6D的载体控制K562细胞(V)或K562株细胞系衍生物制备cDNA。WT1靶基因的表达AREG等-1、VDR、JunB和非WT1靶基因Bax公司GAPDH公司误差条是三个独立实验的SDM*经Student t检验,p<0.05。免疫印迹证实BASP1衍生物是等效表达的。(B) 利用BASP1抗体对表达野生型BASP1或BASP1 G2A的K562提取物进行免疫沉淀,免疫沉淀要么用BASP1(上述)抗体进行免疫印迹,要么用PIP2抗体进行斑点印迹。(C) 表达野生型BASP1或G2A突变衍生物的K562细胞的核提取物与对照、PIP2或PIP3琼脂糖珠培养。用BASP1抗体对稳定结合产物进行免疫印迹。(D) 用表达野生型BASP1或突变BASP1衍生物G2A的载体控制K562细胞(V)或K562电池与对照IgG、WT1、BASP1和PIP2抗体进行ChIP。数据显示为褶皱富集AREG等,VDR、和6月B日启动子区域与对照基因组区域的比较。误差条是三个独立实验的SDM*经Student t检验,p<0.05。(E) 对表达野生型BASP1(wt BASP1)或突变衍生物G2A的载体控制K562细胞(V)或K562电池进行模拟处理(Ctrl)或用100 nM PMA处理,72小时后成像。下面显示了树状细胞百分比的定量(误差条是三个独立实验的SDM;*p<0.05,通过Student t检验)。
图4
图4。肉豆蔻酰化BASP1向启动子招募功能性HDAC1
(A) BASP1抗体或对照IgG用于HeLa核提取物的免疫沉淀,并进行组蛋白脱乙酰酶分析。误差条是三个独立实验的SDM*经Student t检验,p<0.05。(B) BASP1如(A)所示进行免疫沉淀,并用所示的HDAC抗体进行免疫印迹。(C) BASP1是从表达野生型BASP1或BASP1 G2A的K562细胞中免疫沉淀出来的,样本用BASP1(top)或HDAC1抗体进行免疫印迹。α-IgG是对照抗体。(D) 如(C)所示,但抗WT1抗体用于免疫沉淀,HDAC1和BASP1通过免疫印迹法(如上)检测,或抗CapZ抗体用于免疫沉降,然后使用BASP1抗体进行免疫印迹。(E) 表达野生型BASP1或BASP1 G2A的K562细胞的核提取物与对照琼脂糖珠或含有PIP2的珠培养。结合部分用所示抗体进行免疫印迹。(F) 使用表达野生型BASP1(wt BASP1)的载体控制K562细胞或K562电池,或带有控制IgG、HDAC1或乙酰基H3K9抗体的突变BASP1衍生物G2A进行ChIP。数据显示为褶皱富集AREG等,VDR、和6月B日启动子区域与对照基因组区域的比较。误差条是三个独立实验的SDM*经Student t检验,p<0.05。

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