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.2012年8月22日；32(34):11750-62.
doi:10.1523/JNEUROSCI.0234-12.2012。

细胞外α-同核蛋白寡聚体通过NMDA受体激活调节突触传递并损害LTP

玛丽亚·何塞·迪奥基因 1, Raquel B直径, 迪奥戈·M·隆博, 雨果·文森特·米兰达, 弗朗西丝卡·马约利诺, 帕蒂西亚·格雷罗, 托马斯·纳斯特罗姆, 亨利·G·弗兰奎利姆, 路易斯·M·A·奥利维拉, 米格尔A R B卡斯坦霍, 拉尔斯·兰费尔特, 约阿金·伯格斯特伦, 马丁·英格尔森, 亚历山大·昆塔斯, 安娜·M·塞巴斯蒂昂, 路易斯·洛佩斯, 蒂亚戈·弗莱明·奥泰罗
附属公司

细胞外α-同核蛋白寡聚体通过NMDA受体激活调节突触传递并损害LTP

玛丽亚·何塞·迪奥奇尼斯等。 神经科学. .

摘要

帕金森氏病（PD）是一组被称为同核蛋白病的疾病的最常见代表，其中α-同核蛋白（a-syn）在不同脑区的错误折叠和聚集是主要的病理特征。事实上，PD的运动症状是由大脑神经元的异质性变性引起的，不仅在黑质致密部，而且在大脑的其他纹状体外区域。除了众所周知的PD患者的运动功能障碍外，认知障碍和记忆障碍也是该疾病的重要组成部分，可能是由于纹状体外区域（包括海马）的突触传递和可塑性中断所致。在这里，我们研究了a-syn聚集对AMPA和NMDA受体介导的大鼠海马（CA3-CA1）突触传递和长时程增强（LTP）（学习和记忆的神经生理学基础）的影响。我们的数据表明，长时间接触a-syn低聚物，而不是单体或纤维，会通过NMDA受体激活增加基础突触传递，从而触发钙通透性AMPA受体的增强作用。用a-syn低聚物处理的切片不能对θ突发刺激进一步增强作出反应，导致LTP受损。先前递送的低频序列恢复了LTP的表达能力，这意味着暴露于a-syn低聚物会驱动谷氨酸能突触传递的增加，从而阻止生理刺激的进一步增强。我们的新发现为a-syn低聚物如何在PD和其他突触核蛋白疾病中引发神经元功能障碍和毒性提供了机制上的见解。

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数字

图1。
图1。
a-syn物种和生物效应的表征。一，不同a-syn物种（单体、低聚物、HNE低聚物和原纤维）的SDS-PAGE分离。单体随着单体分子量（15 kDa）迁移，而a-syn低聚物、a-syn HNE低聚物和纤维显示出抗SDS的高分子量物种。b条Thioflavin T在不同a-syn物种存在下的归一化荧光分析，激发波长和发射波长分别为450和490 nm。a-syn低聚物、a-syn HNE低聚物和原纤与硫黄素T相互作用，表明它们显示出增加的β-片结构，这是低聚物与原纤物种的典型特征。c（c）不同a-syn物种的AFM分析。单体无可检测物种；a-syn低聚物和a-syn HNE低聚物表现为具有球状和原纤维结构的异质群体；纤维显示纤维结构。比例尺，500 nm。d日，SH-SY5Y细胞中a-syn物种的细胞毒性。与不同a-syn物种孵育的SH-SY5Y细胞的LDH活性。LDH释放量表示为未处理（Ctrl）样品的相对水平。数据表示为平均值±SD，n个= 3.e（电子）为了控制可能过度接触a-syn，我们进行了免疫印迹分析，将内源性a-syn与经a-syn寡聚物（500 n米；90分钟）。我们检测到暴露于外源性a-syn的切片中约15%的掺入量增加。
图2。
图2。
a-syn寡聚物损害LTP。一，θ突发刺激引起对照切片fEPSP斜率的变化(○,n个=6）和用a-syn寡聚物预孵育的切片(●,n个=6500牛顿米；90分钟）。b条LTP诱导前（1）和诱导后（2）46–60分钟获得的代表性实验的痕迹，由刺激伪影、突触前抽射和fEPSP组成。c（c），对照切片中由θ突发刺激引起的fEPSP斜率变化(○,n个=3）和与a-syn单体物种预先孵育的切片(●,n个=3500牛顿米；90分钟）。d日，θ突发刺激引起对照切片fEPSP斜率的变化(○,n个=3）和与a-syn HNE低聚物预孵育的切片中(●；n个=5）（500牛顿米；90分钟）。e（电子），θ突发刺激引起对照切片fEPSP斜率的变化(○,n个=3）和用a-syn原纤维预先孵育的切片(●、，n个=3500牛顿米；90分钟）。（f）、对照切片和与a-syn寡聚物（500 n）预孵育的切片中的θ突发刺激相对于θ突发前值（100%）诱导的LTP幅度（46–60 min时fEPSP斜率的变化）米；90分钟），a-syn单体（500 n米；90分钟）和a-syn原纤维（500 n米；90分钟），如下所示。所有值均为平均值±SEM。克，θ突发刺激引起对照切片fEPSP斜率的变化(○,n个=3）和用胰岛素低聚物预孵育的切片(●,n个=3500牛顿米；90分钟）。小时，由θ突发刺激引起的LTP幅度图（46–60分钟时fEPSP斜率的变化），与实验中的θ突发前值（100%）相关克如下所示。所有值均为平均值±SEM。
图3。
图3。
未修饰的和HNE a-syn低聚物诱导的LTP损伤通过NMDA受体阻断完全恢复。一用NMDA受体拮抗剂APV（50μ米)，使用(n个=4）或不带(n个=5）a-syn低聚物物种(*第页< 0.05,t吨测试）。b条，由θ突发刺激引起的LTP幅度图（50–60分钟时fEPSP斜率的变化），与实验中的θ突发前值（100%）相关一如下所示。c（c）NMDA受体拮抗剂APV（50μ米)，使用(n个=4）或不带(n个=3）HNE a-syn低聚物(*第页< 0.05,t吨测试）。在一和c（c）纵坐标表示标准化的fEPSP斜率，其中100%对应于θ波刺激前10分钟记录的平均斜率，横坐标表示时间（min）。d日，由θ突发刺激引起的LTP幅度图（46–60分钟时fEPSP斜率的变化），与实验中的θ突发前值（100%）相关c（c）如下面每列所示。所有数值均为平均值±SEM。
图4。
图4。
a-syn低聚物增强海马的基础突触传递。一，对应于对照切片中不同刺激强度（60–300μA）诱发的纤维凌空抽射振幅和fEPSP斜率之间产生的响应的I/O曲线(○,n个=5），用a-syn低聚物处理的切片(●,n个=6）（500牛顿米，90分钟），并用a-syn低聚物处理切片(■,n个=4）与50μ共立方米APV。a-syn低聚物诱导的突触传递增加通过与APV共培养完全恢复(*第页<0.05，方差分析F类测试）。b条，用APV灌流30分钟后fEPSP斜率变化的平均时间过程(●,n个=4）或不带(○,n个=4）a-syn低聚物物种（500 n米，90分钟）(*第页< 0.05,t吨测试）。在用a-syn低聚物处理的切片中，急性应用APV会导致EPSP斜率降低。c（c），急性APV灌流实验的平均fEPSP（自最后10分钟应用APV后的斜率变化），如下各栏所示。所有值均为平均值±SEM。
图5。
图5。
使用HNE低聚物治疗会导致LTP饱和，而先前的LFS会逆转这种饱和。一，代表性控制切片中连续两次θ-突发刺激引起的fEPSP斜率变化(○) 并在与a-syn寡聚物物种预先孵育的切片中(●, 500牛顿米；90分钟）。b条，对照切片中与基线值（100%；−10至0分钟）相关的θ脉冲刺激引起的LTP2/LTP1比值（LTP1:在46–60分钟时fEPSP斜率的变化；LTP2:在106–120分钟时fEP斜率的改变）(n个=3）和那些与HNE a-syn寡聚物物种预先孵育的物种(n个= 3; 500牛顿米；90分钟）(*第页< 0.05,t吨测试）。c（c），在用HNE a-syn低聚物（500n米；90分钟）●,n个=4）或不带(○,n个=4）之前交付的LFS方案将突触传递减少了8.3±6.8(n个= 4).d日、LTP幅度（46–60分钟时fEPSP斜率的变化），由θ突发刺激引起，与预先培养HNEα-合成寡聚物（500 n）的切片中的θ突发前值（100%）相关米；90分钟）(n个=4）或不带(n个=4）之前交付LFS协议，如下各栏所示*第页< 0.05,t吨测试。所有值均为平均值±SEM。
图6。
图6。
a-syn低聚物治疗与突触传递中NMDA成分增加有关。一，APV（50μ米，20分钟）显著降低a-syn HNE寡核苷酸处理神经元的EPSC振幅(●) 但不在控制范围内(○), 如中所示的代表性电流轨迹所示b条APV的作用如APV应用归一化到基线周期后诱发的EPSC振幅所示(c（c）). (*第页< 0.05,t吨测试，n个=每组11人）。d日，APV（50μ米)用a-syn寡聚物处理神经元20分钟后，EPSC振幅降低(●) 但不在控制神经元中(○).e（电子）APV灌流的平均效应表示为用药后EPSC振幅标准化至基线期。(第页< 0.05,n个=每组4人）。（f），CNQX阻断EPSC（10μ米，20–25分钟）在对照神经元中几乎完成(○) 但在使用a-syn HNE低聚物治疗的患者中没有(●), 小的剩余电流随后可能被APV阻断。代表性电流追踪(克)显示了每种情况，对应于基线期和CNQX灌注后（对照和治疗神经元）；此外，还显示了HNE a-syn寡聚体处理神经元在APV灌注后记录的轨迹。小时，与对照组相比，a-syn HNE寡核苷酸处理的神经元在CNQX存在下记录的残余电流（归一化为基线期）显著增大(n个=每组7人*第页< 0.05,t吨测试）。我CNQX阻断EPSC（10μ米，20–25分钟）在对照神经元中几乎完成(○）但在用a-syn低聚物处理的那些细胞中没有(●) 小的剩余电流随后被APV阻断。j个，在a-syn寡核苷酸处理的神经元中，CNQX存在时记录的残余电流（归一化为基线期）显著增大(n个=4）比对照组(n个= 6) (*第页< 0.05,t吨测试）。
图7。
图7。
a-syn HNE低聚物诱导AMPA受体亚单位组成的变化。一，标准化EPSCNMDA公司控制条件下神经元记录的电流-电压关系(○,n个=5）和与a-syn HNE低聚物孵育后(●,n个=7），在CNQX（10μ米).b条，EPSC代表NMDA公司在+40和-90 mV下记录的每个条件的记录道。c（c）、校正指数值（EPSC−90毫伏/EPSC公司+40毫伏)对于NMDA受体介导的EPSC，根据对照和a-syn HNE低聚物计算。d日、归一化EPSC图AMPA公司在APV（50μ米)来自控件(○,n个=11）和a-syn HNE-低聚物处理(●,n个=9）处理过的切片。e（电子），EPSC代表AMPA公司在+40和-60 mV下从对照和a-syn HNE低聚物中记录的痕量。（f）、校正指数值（EPSC+40毫伏/EPSC公司−60毫伏)对于AMPA受体介导的EPSCs，根据对照和a-syn HNE寡聚体处理的神经元计算(*第页< 0.05,t吨测试）。克,小时,我，NASPM前后单个EPSC振幅图（100μ米，20分钟）灌流。NASPM显著降低了a-syn HNE寡聚物处理的神经元的EPSC振幅(●,n个=6）但不在对照组(○,n个=6）也不适用于与HNE低聚物和APV（50μ米) (●,n个= 4).j个，NASPM的影响显示为NASPM超灌注后标准化为基线期的平均EPSC振幅(*第页< 0.05,t吨测试）。所有值均为平均值±SEM。k个，用a-syn HNE低聚物（500 n）孵育大鼠海马脑片样品的免疫印迹分析米；90 min）和对照组，采用生物素化技术并用抗GluR1抗体进行免疫印迹。在用a-syn HNE低聚物培养的样品中，可以检测到GluR1亚基水平的膜部分的增加。我，三个独立实验的量化。统计显著值(*第页< 0.05t吨测试）归一化为总分数。
图8。
图8。
CA1锥体突触中a-syn寡聚体诱导的LTP损伤模型。一，在生理条件下，θ突发刺激（TBS）诱导Ca2+通过NMDA受体流入突触后细胞并激活钙调素（CaM）。通过目前未知的机制，Ca2+/CaM激活Ca2+/CaM-依赖性蛋白激酶II（CaMKII），通过GluR1亚单位的磷酸化调节突触效率。除了促进单通道电导的增强外，CaMKII还促进钙渗透性AMPA受体向突触后膜的转运和瞬时插入，这被认为对LTP的诱导和/或稳定至关重要。b条，当暴露于a-syn低聚物时，突触失去对θ突发刺激的反应能力。在静息突触中，寡聚体能够直接或间接激活NMDA受体，导致NMDA通道对传递的贡献增加。这促进了细胞内钙的基本增加和AMPA受体运输的调节，有利于插入电导较高的钙渗透性AMPA受体，而非促进基础突触传递的含GluR2的AMPA受体。每当被θ突发激活时，突触就会饱和，无法再吸收额外的AMPA受体，这就意味着长期增强能力受损。
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