跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2012;7（7）：e41242。
doi:10.1371/journal.pone.0041242。 Epub 2012年7月24日。

PAD2在乳腺癌细胞基因调控中的潜在作用

布莱恩·德·切林顿 1, 张学森, 约翰·麦克尔维, 埃里克·莫伦西, Lynne J痛苦, 斯科特·A·库恩罗德
附属公司

PAD2在乳腺癌细胞基因调控中的潜在作用

布莱恩·德·切林顿等。 公共科学图书馆一号. 2012.

摘要

肽基精氨酸脱氨酶（PAD）家族的酶在翻译后将底物蛋白中带正电的精氨酸残基转化为中性的非标准残基瓜氨酸。PAD家族成员1、2、3和6以前定位于细胞质，因此，他们调节基因活性的潜力尚未被描述。我们最近证明，PAD2在犬乳腺上皮中表达，并且该组织中的组蛋白瓜氨酸化水平与PAD2表达相关。鉴于这些观察结果，我们决定测试PAD2是否定位于人类乳腺上皮的核隔室并调节这些细胞中的基因活性。在这里，我们首次表明，PAD2在人类乳腺上皮细胞中特异表达，并且PAD2的一部分与MCF-7乳腺癌细胞中的染色质相关。我们通过微阵列、qPCR和染色质免疫沉淀分析研究了PAD2的潜在核功能。结果表明，在MCF-7细胞PAD2缺失后，一个独特的基因子集的表达不受调控。此外，对两个高度上调和下调的基因（分别为PTN和MAGEA12）进行的ChIP分析发现，PAD2直接与这些基因启动子结合，并且PAD2调节这些基因表达的可能机制是通过组蛋白H3尾部精氨酸残基2-8-17的瓜氨酸化。因此，我们的发现确定了PAD2在人类乳腺上皮细胞基因表达中的新作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：库恩罗德博士是《公共科学图书馆·综合》编委会成员。这并没有改变作者对PLoS ONE关于共享数据和材料的所有政策的遵守。

数字

图1
图1。PAD2在人类子宫内膜、肾脏、乳腺导管和管腔上皮细胞中表达。
（A） 子宫内膜、（B）肾、（C）乳腺导管和（D）乳腺肺泡上皮细胞表达PAD2，而邻近组织中无PAD2染色（或染色较弱）。组织切片用抗PAD2抗体或等浓度的兔IgG作为对照，并用苏木精进行复染。黑色箭头表示不同组织之间细胞核中PAD2染色不同的上皮细胞。
图2
图2。在人乳腺管腔上皮细胞的细胞质和细胞核中检测到PAD2。
（A） PAD2在人乳腺腔细胞而非肌上皮细胞中表达。用抗PAD2（绿色荧光信号）、抗细胞角蛋白（管腔标记物-红色荧光信号）和抗p63（肌上皮标记物-红荧光信号）抗体或等浓度的兔、鼠IgG作为对照，检测正常人乳腺组织切片，并用DAPI染色细胞核。（B） 人类乳腺上皮细胞中的一部分PAD2染色在细胞核中检测到。正常人乳腺组织切片用抗PAD2（绿色荧光信号）探针探测，细胞核用DAPI染色。白色箭头所示为细胞核内PAD2染色强烈的乳腺上皮细胞。
图3
图3。PAD2与MCF-7细胞细胞核中的染色质结合。
（A） PAD2在MCF-7细胞中内源性表达，并在多个细胞室中检测到。对野生型和PAD2过表达的MCF-7全细胞裂解物进行SDS-PAGE，并用抗PAD2抗体进行检测。抗狂犬病IgG作为阴性对照。（左侧面板）。内源性MCF-7细胞蛋白也通过分馏方法分离到细胞质、染色质和可溶性核池中，并通过western blot进行检测（右图）。通过剥离膜并用TBP（核蛋白）和SOD4（细胞质蛋白）抗体进行再防护来确定分馏的清洁度。（B） 在MCF-7细胞的细胞核中检测到点状PAD2的表达。MCF-7细胞使用抗PAD2（绿色）、抗细胞角蛋白（管腔红）、抗H3K9乙酰基（常染色质红）、反HP1（异染色质红），抗H3K9二甲基（兼性异染色质红）和抗H3K17三甲基（兼性异染色素红）抗体进行IF，而DAPI核染色为蓝色。白色箭头表示DAPI贫乏核区PAD2染色的标点。
图4
图4。截短的FLAG标记的PAD2蛋白揭示了核定位所必需的区域。
（A） 顶部的示意图显示了140、278和437个氨基酸的不同截短PAD2蛋白。截短的FLAG-PAD2构建物在HEK 293细胞中过表达，并通过SDS-PAGE分析裂解产物进行验证。用抗FLAG抗体探测膜，该抗体检测到截短蛋白的预测分子量，而β-肌动蛋白显示负载控制。（B） PAD2的截短揭示了通过细胞分离进行亚细胞定位所必需的蛋白质区域。截短的FLAG-PAD2构建物在HEK 293细胞中过度表达，然后用分馏方法分离细胞蛋白并用western blot检测。通过剥离膜并用组蛋白H3（核）和SOD4（细胞质）蛋白的抗体进行再propro来确定分馏的清洁度。还将截短的FLAG-PAD2构建物瞬时转染到HEK 293细胞中，并使用抗FLAG抗体（绿色荧光信号）通过IF（B底部面板）检测亚细胞定位，以证实细胞分馏研究。（C） PAD2的截短揭示了IF在乳腺上皮细胞中定位亚细胞所需的蛋白质区域。截短的FLAG-PAD2构建物在MCF-7细胞中过度表达，并使用抗PAD2（绿色）和抗细胞角蛋白（红色）抗体进行IF检测，而DAPI核染色为蓝色。
图5
图5。PAD2在MCF-7细胞的基因表达中起作用。
（A） 与shRNA对照组相比，PAD2敲低MCF-7细胞中的PAD2水平显著降低。使用抗PAD2抗体和抗β-肌动蛋白抗体作为负荷对照，通过western blot分析shRNA对照和PAD2敲低MCF-7细胞的全细胞裂解产物。从PAD2敲除的MCF-7和shRNA控制细胞中纯化RNA，进行逆转录，得到用于qPCR反应的cDNA，其中包含以PAD2和GAPDH作为参考基因控制的TaqMan分析。数据表示四个独立实验的平均值±SEM，一式三份。所有值均归一化为shRNA对照样品，条形代表平均值±SEM。平均值通过Student’s T检验分离，**代表显著差异（P<0.01）。（B） 微阵列和qPCR验证研究表明，PAD2参与MCF-7细胞的基因调控。该表显示了shRNA控制和PAD2敲低MCF-7细胞之间表达谱发生显著变化的基因样本。数字表示日志2P<0.001和FDR<0.01的对照和PAD2敲除细胞系之间表达的倍数变化比率。为了验证微阵列研究，从shRNA对照和PAD2敲低MCF-7细胞中获取总RNA并进行逆转录。结果cDNA用于表S1中列出的特异性引物的qPCR反应。该图显示了原木的折叠变化2对照和PAD2敲低细胞系之间的表达比率，P＜0.05。（C） PAD2和稳定过度表达FLAG-tagged PAD2的MCF-7细胞中的PTN和MAGEA12基因启动子相关。使用抗FLAG抗体进行ChIP-qPCR研究，数据显示为过度表达FLAG-标记PAD2的MCF-7细胞信号在以β-actin和GAPDH为对照的对照细胞上的倍数变化。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。（D） PTN和MAGEA12基因启动子使用shRNA控制和PAD2敲低MCF-7细胞显示组蛋白H3的瓜氨酸化，但组蛋白H4尾部精氨酸残基没有瓜氨酸化。使用抗H3 cit 2–8–17和H4 cit 3抗体进行ChIP-qPCR研究，数据以GAPDH启动子作为对照输入的%表示。数据表示三个独立实验的平均值±SEM，以及通过单尾T检验分离的平均值。
图6
图6。与对照细胞相比，敲除MCF-7细胞内源性PAD2改变细胞增殖率。
将等量的shRNA对照细胞和PAD2敲除的MCF-7细胞接种在96周的平板中，并允许其生长24、48或72小时。收获时，允许MTT分析试剂盒中的染料溶液与细胞孵育1小时，在此点添加增溶试剂，并在570 nm处测量得到的甲氧嗪产品。数据表示一式三份的三个独立实验的平均值±SEM。数值代表平均值±SEM。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. 铃木A、山田R、Chang X、德弘S、Sawada T等。编码瓜氨酸化酶肽基精氨酸脱氨酶4的PADI4功能性单倍型与类风湿关节炎相关。自然遗传学。2003;34:395–402.-公共医学
    1. Mastronardi FG、Mak B、Ackerley CA、Roots BI、Moscarello MA。DM20转基因小鼠髓磷脂碱性蛋白的修饰与多发性硬化髓磷脂碱性蛋白质的修饰相似。临床投资杂志。1996;97:349–358.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Ishigami A、Ohsawa T、Hiratsuka M、Taguchi H、Kobayashi S等。阿尔茨海默病患者海马提取物中肽基精氨酸脱氨基酶催化的瓜氨酸蛋白异常积聚。神经科学研究杂志，2005年；80:120–128.-公共医学
    1. Chang X，Han J.肽酰精氨酸脱氨酶4型（PAD4）在各种肿瘤中的表达。霉菌致癌。2006;45:183–196.-公共医学
    1. Luo Y、Knuckley B、Lee YH、Stallcup MR、Thompson PR。一种基于氟乙酰胺的精氨酸脱亚胺酶4灭活剂：设计、合成、体外和体内评价。2006年美国化学学会杂志；128:1092–1093.-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型