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.2012年8月14日；109(33):13428-33.
doi:10.1073/pnas.1204089109。 Epub 2012年7月30日。

CAG扩增诱导聚谷氨酰胺疾病中的核仁应激

何措 1, 特伦斯·齐孔刘, 苏英曾, 郭飞（Kwok-Fai Lau）, 何寅·埃德温·陈
附属公司

聚谷氨酰胺疾病中CAG扩张引起核仁应激

何聪等。 美国国家科学院程序. .

摘要

细胞核是聚谷氨酰胺（polyQ）毒性的主要部位，但其潜在机制尚未完全阐明。在这里，我们报道了携带扩展CAG重复序列的突变RNA（扩展CAG RNA）通过激活polyQ患者和转基因动物疾病模型中的核仁应激途径诱导细胞凋亡。我们发现扩张的CAG RNA与核仁蛋白（NCL）直接相互作用，核仁蛋白是一种调节rRNA转录的蛋白质。这种RNA-蛋白相互作用剥夺了NCL与rRNA启动子上游控制元件（UCE）的结合，从而导致UCE DNA超甲基化，进而干扰rRNA转录。rRNA转录下调通过促进核糖体蛋白和MDM2之间的物理相互作用，诱导核仁应激并引发凋亡。最后，我们发现线粒体p53破坏了抗凋亡蛋白Bcl-xL和促凋亡蛋白Bak之间的相互作用，从而导致细胞色素c释放和caspase激活。我们的研究提供了体内证据，证明扩张的CAG RNA触发核仁应激并通过p53诱导凋亡，并描述了涉及核仁的polyQ致病机制。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
扩增的CAG RNA受到干扰rRNA转录和诱导的核仁应激。(A–C)实时PCR分析前rRNA中的表达式果蝇属(A类和B类)和45s前rRNA,GAPDH公司,6号机组、和tRNA遇见细胞内表达(C类)模型表示CAG公司构造。误差线代表±SD。这个实验重复了三次。(天–F)核糖体蛋白的协同免疫沉淀[RpL5(天)，RpL11(E类)和RpL23(F类)]和CAG RNA表达细胞中的MDM2 E3泛素连接酶。(G公司)扩大CAG RNA表达对p53蛋白稳定性的影响。CHX代表环己酰亚胺，用于抑制从头合成蛋白质。Tubulin被用作负荷控制。(H（H）)扩大CAG RNA表达对p53线粒体积累的影响。微管蛋白和谷氨酸脱氢酶（GDH）分别用作细胞溶质和线粒体分馏控制。(我)Bcl-xL与p53和Bak的免疫共沉淀。(J型)细胞色素的细胞溶胶和线粒体分馏c（c）在CAG RNA表达细胞中。Tubulin和GDH分别用作细胞溶质和线粒体分离对照。(K（K）)扩增的CAG RNA表达对caspase 3和poly（ADP核糖）聚合酶裂解的影响。Tubulin被用作负荷控制。“+”表示免疫沉淀反应中存在抗体，“−”表示反应中不包含抗体。所有实验重复三次，并显示了具有代表性的斑点或凝胶。
图2。
图2。
扩张的CAG RNA干扰了rRNA转录前启动复合物和促进超甲基化rRNA启动子. (A类和B类)RNA聚合酶I最大亚单位（RPA194）的染色质免疫沉淀和rRNA启动子(A类)和上游结合因子（UBF）以及上游控制元件(美国大学) (B类)在CAG RNA表达细胞中。“+”表示免疫沉淀反应中存在抗体，“−”表示反应中不包含抗体。(C类)DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷对扩张型CAG RNA诱导的作用联合国教育、科学及文化组织CpG DNA超甲基化。实时PCR分析美国大学显示DNA甲基化状态。误差线代表±SD。所有实验重复三次。
图3。
图3。
扩张的CAG RNA和核仁素之间的物理相互作用破坏了核仁素与上游控制元件. (A类)的下拉MJD公司CAG公司用NCL免疫沉淀法检测RNA。“+”表示免疫沉淀反应中存在抗体，“−”表示反应中不包含抗体。该实验重复了三次，并显示了一种具有代表性的凝胶。(B类)NCL和扩增CAG RNA之间的直接物理相互作用。纯化GST-NCL蛋白和体外转录RNA(CAG公司78和CUG公司78)用于结合反应。非融合GST蛋白作为阴性对照。通过Western blotting证实GST-NCL蛋白的表达。该实验重复了四次，并显示了一个具有代表性的印迹。(C类)实时PCR分析45s前rRNA表达式级别NCL公司siRNA处理的细胞。误差线代表±SD。这个实验重复了三次。(天)实时PCR分析美国大学DNA甲基化状态NCL公司siRNA处理的细胞。误差线代表±SD。这个实验重复了三次。(E类)上游结合因子（UBF）和上游控制元件(美国大学)英寸NCL公司siRNA处理的细胞。进行实时PCR分析以确定UBF–美国大学互动。误差线代表±SD。这个实验重复了三次。(F类)NCL的染色质免疫沉淀与扩增的CAG RNA和联合国教育、科学及文化组织在细胞中。“+”表示免疫沉淀反应中存在抗体，“−”表示反应中不包含抗体。该实验重复了三次，并显示了一种具有代表性的凝胶。
图4。
图4。
核仁蛋白过度表达恢复rRNA转录和抑制核仁应激。(A类)实时PCR分析上游控制元件(美国大学)共表达CAG RNA和NCL公司误差条表示±SD。这个实验重复了三次。(B类和C类)上游结合因子（UBF）的染色质免疫沉淀和美国大学在有或无CAG RNA表达细胞中NCL公司共表达。进行实时PCR分析以确定UBF–美国大学互动。误差线代表±SD。这个实验重复了三次。(天)实时PCR分析45s前rRNA联合转染细胞的表达水平CAG公司和NCL公司构造。误差线代表±SD。这个实验重复了三次。(E类)影响NCL公司在扩张的CAG RNA表达细胞中过度表达p53蛋白稳定和caspase 3和poly（ADP核糖）聚合酶的裂解。“+”表示NCL公司过表达和“−”表示没有NCL公司过度表达。该实验重复了三次，并显示了一个具有代表性的印迹。
图5。
图5。
通过扩展CAG RNA激活核仁应激信号的拟议模型。扩张的CAG RNA的表达与核仁蛋白（NCL，浅蓝色）直接相互作用。CAG特异性RNA-蛋白相互作用的扩大导致CpG的超甲基化（倒三角形）上游控制元件(联合国教育、科学及文化组织，紫色）在rRNA启动子并导致rRNA转录。一个功能性核糖体由二者组成rRNA和核糖体蛋白。降低了rRNA导致游离核糖体蛋白质（如RpL5、RpL11和RpL23，橙色）的积累。游离核糖体蛋白和E3泛素连接酶MDM2（蓝色）之间的相互作用导致线粒体积聚p53。p53和抗凋亡蛋白（Bcl-xL，橙色）之间的相互作用导致线粒体膜上促凋亡蛋白（Bak，灰色）的寡聚并导致细胞色素c（c）（浅紫色）释放。细胞溶胶细胞色素c（c）反过来激活caspase级联并诱导凋亡。
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