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.2012年7月9日;198(1):127-41.
doi:10.1083/jcb.201205025。 Epub 2012年7月2日。

施万细胞中的c-Jun通过旁分泌信号促进轴突再生和运动神经元存活

附属公司

施万细胞中的c-Jun通过旁分泌信号促进轴突再生和运动神经元存活

泽维尔·丰塔纳等。 J细胞生物学. .

摘要

AP-1转录因子c-Jun是神经元轴突反应的主调节器。c-Jun也是雪旺细胞(SCs)髓鞘形成的负调节因子,在轴突损伤后SCs中强烈重新激活。我们在此证明,损伤后,SCs中c-Jun的缺失导致轴突再生受损,神经元细胞死亡严重增加。c-Jun缺乏导致几种神经营养因子表达减少,GDNF和Artemin均编码Ret受体酪氨酸激酶配体,被鉴定为新的直接c-Jun靶基因。神经元中特异性Ret的基因失活导致再生缺陷,但不影响运动神经元的存活,相反,注射重组GDNF和Artemin蛋白可显著改善c-Jun缺乏引起的再生障碍。这些结果揭示了c-Jun在SCs中对轴突损伤的意外功能,并确定旁分泌Ret信号是再生过程中SCs中c-Jun功能的重要介导。

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数字

图1。
图1。
六月SC缺失会干扰神经元的存活和再生。(A和B)恢复胡须毛发运动(WHM)。(A) WHM得分范围为0分(无动作)到3分(有力、正常动作);有关详细信息,请参见材料和方法。数据点显示了平均值±SEM六月ΔSC(n个=6)和他们的垃圾控制(n个= 9). *, 非配对双尾犬P<0.05在这个图和下面的所有图中进行测试。(B) 基于曲线下面积(AUC)的每只动物的WHR恢复指数(WHM RI),在A中进行评估。六月ΔSC显示整体恢复非常显著较差,0.82±0.09六月飞行/飞行动物和0.31±0.03六月ΔSC(平均值±SEM);P<0.05,学生测试。(C–G)如果没有六月SC中;与A和B中的动物相同。(C)面部切割后28天,将FG涂抹到两个胡须垫上,然后72小时存活后,轴切侧(Ax)和对侧(Co)逆行标记的面部运动神经元的比率。(D–G)FG逆行标记的代表性图像。在未损伤侧(对侧),逆行标记面部运动神经元主要位于外侧亚核(D和F),但在切割后出现随机分布于整个细胞核(E和G)。注意,突变体轴切侧标记神经元数量急剧减少六月ΔSC(n个=6)和他们的垃圾控制(n个=9)(G)与对照(E)动物进行比较。对照组(H)和突变组(I)动物单侧轴切开31天后的(H和I)Nissl染色脑干冠状切片。面部运动核(7n)以虚线为界。注意运动神经元的急剧减少六月ΔSC动物在轴切侧(ax)。H中的Bar(也适用于I),0.2 mm。定量结果显示,J运动神经元细胞计数显示,在神经切断后31天,在没有SC c-Jun的情况下,存活率显著下降六月ΔSC(n个=6)和他们的垃圾控制(n个=9),与A–I中的动物相同。(K) 每20µm厚切片中面部运动核内的αX+小胶质结节数(n个= 5六月ΔSC突变体和n个= 5六月飞行/飞行控件)。(五十) 面神经挤压后4天,生长最快的CGRP+和甘丙肽+运动轴突的再生距离(mm,挤压远端)(n个= 4六月ΔSC突变体和n个= 4六月飞行/飞行控件)。(M) 挤压后4 d,面神经损伤部位(0 mm)和远端2 mm和4 mm处αM+巨噬细胞的密度(n个= 4六月ΔSC突变体和n个= 4六月飞行/飞行控件)。(J–M)*,学生中P<0.05测试。
图2。
图2。
失神经SCs对神经营养因子基因表达的激活依赖于六月上调监管。(A)六月ISH对一只野生型小鼠坐骨神经损伤后7天的纵切面进行损伤。横向虚线表示近似挤压损伤。还显示了近端和远端树桩的方向。矩形标记了两个代表性区域,如B和C所示。(B和C)从近端(左侧)和远端(右侧)残端A到病变的高倍放大。(D) 损伤后7d野生型的共焦成像(六月飞行/飞行)和突变型(六月ΔSC)坐骨神经纵切面。SC祖细胞标记物p75神经营养素受体(p75NTR;绿色,左)和总c-Jun(红色,中)的双重免疫荧光。合并图像显示在右侧。DNA(蓝色)用DAPI复染。箭头表示p75NTR+SC祖细胞与c-Jun共存。(E)Superarray比较损伤后7天坐骨神经的神经营养素基因表达水平。将突变神经的折叠变化值归一化为野生型水平(基线值1;n个=7六月飞行/飞行小鼠和n个=6,用于六月ΔSC来自单个实验的小鼠)。(F) Q-PCR对E中所示超阵列所得结果的确认。将突变神经的折叠变化值归一化为野生型水平(基线值1;三个重复的平均值,n个=7六月飞行/飞行小鼠和n个=6,用于六月ΔSC来自单个实验)。棒材:(A)100µm;(B;也适用于C)25µm;(D;左上角图像中的条适用于整个面板)10µm。
图3。
图3。
cAMP治疗后神经损伤或髓鞘形成条件下SCs的转录谱。(A) ISH用于阿尔顿GDNF公司上的基因六月飞行/飞行六月ΔSC未损伤坐骨神经或损伤部位近端和远端残端挤压后7d。矩形表示右侧最后一个面板上放大倍数较高的区域。(B) Q-PCR显示了与未损伤的野生型神经相比,损伤后7天的坐骨神经基因表达的变化(未损伤神经的基线值为1;显示的数字是三次重复的平均值,n个=5只受伤或对照野生型动物,两个实验中的代表性实验)。(C) cAMP治疗5d后原代SC培养物的Q-PCR(未治疗的基线值,1)。绘制的值是两个独立实验的平均值,每个实验有三个重复。在每一次实验中,收集来自单个幼崽的样本。在两个独立的实验中,对每种情况下的10只P2-P5幼崽进行了分析。误差条表示两个平均值的SD。*,P<0.05(学生的测试)。(D) 野生型小鼠SC原代培养物的Q-PCR。在比较过度表达c-Jun(腺病毒–c-Jun)的培养物与模拟感染培养物(腺病毒-GFP)时,该图显示了折叠基因的表达。数字是三个重复的平均值,n个=10只P2-P5幼崽在每种情况下聚集在一起,这是两个实验中的代表性实验。(E) 对对照组和c-Jun缺失突变小鼠的面神经切断后的面运动神经元中Ret激活和下游信号的评估。两种基因型的队列均接受面神经轴切断术,并在损伤后7天对轴切除的面神经核进行显微解剖。然后使用所示蛋白的抗体通过Western blot分析提取物。未受伤的Ret神经元缺失小鼠被用作总蛋白印迹和对-Tyr905 Ret Western印迹的阴性对照。棒材:(A;左下角适用于低倍率的前三列)150µm;(高倍系列,右上柱)25µm。
图4。
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分子分析GDNF公司阿尔顿发起人。(A) IMS32 SC株提取物的蛋白质印迹检测JNK激活(茴香霉素,Anm)或JNK抑制(SP600125)处理后c-Jun和JNK的总版本和磷酸化版本。肌动蛋白被用作负荷控制。(B) 未经处理(白色条)或用茴香霉素(黑色条)或JNK抑制剂(SP600125;灰色条)处理的IMS32 SC系样品的Q-PCR。基因值被标准化为未治疗状态(基线值1)。*,P<0.05,方差分析,n个=3个独立实验。(C和D)显示结构的方案小家鼠GDNF(C) 和阿尔顿(D) 基因座。箭头指示转录起始点。外显子显示为黑色,UTR区域显示为灰色。红点表示每个基因启动子中已识别的AP-1位点的位置。图中显示了AP-1序列的5′–3′物种比对。AP-1位点两侧的红色箭头表示pGL3荧光素酶报告子K(E、G和I)方案中使用的引物的位置GDNF公司(E) 或阿尔顿(G) 或六月(一) 克隆了小鼠启动子片段。红点表示AP-1–绑定顺序。AP-1站点GDNF公司阿尔顿报告结构发生突变(AP-1mut;用十字表示)。显示了位于AP-1两侧的克隆基因组片段的大致大小。(F、H和J)IMS32 SC培养物与每一种构建物以及泛素肾素作为对照进行联合转染。图中显示了pGL3-对照(ctrl)转染细胞的肾小球/荧光素酶折叠诱导比率。培养物要么未经处理,要么用JNK激动剂茴香霉素处理,P<0.05,学生测试;n个=3个独立实验。(K) 显示体内磷酸化-c-Jun与c-6月,GDNF公司、和阿尔顿使用抗磷酸化c-Jun抗体通过染色质免疫沉淀法获得包含AP-1的启动子。AP-1侧翼引物的位置GDNF公司阿尔顿基因在C和D中用红色箭头标记。Gapdh公司基因作为对照。IMS32 SC株培养物隔夜无血清培养,未经治疗或用茴香霉素或JNK抑制剂处理30分钟。这些值代表同型匹配对照免疫球蛋白的倍增,显示了三次重复中的一次代表性实验。
图5。
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Ret信号参与轴切断后面神经核运动神经元的再生。(A和B)野生型总Ret IHC(A,Ret公司飞行/飞行)和突变型(B,Ret公司ΔN)健康的动物。切片用苏木精和伊红复染。面神经核(7n)运动神经元表达Ret公司高水平(A,插图中的箭头)。删除Ret公司在这些运动神经元中,通过与突触蛋白-Cre缺失小鼠杂交,证实缺乏Ret公司B点方框中的染色表示左上角的高倍插图。(C) 面部细胞核Ret公司飞行/飞行Ret公司ΔN对小鼠进行显微解剖,并用Western blot检测Ret水平。(D) WHM RI,如图1B所示,基于每只动物的曲线下面积(AUC)数据。Ret公司ΔNRet公司飞行/飞行对照组(P<0.01,Student’s测试;n个=每个基因型6个)。(E) 胡须垫的靶向再神经化减少Ret公司ΔN老鼠。该图显示了在面神经切断后28天,将FG应用于两个须垫后,轴切侧(Ax)和对侧(Co)逆行标记的面部运动神经元的比率,以及72小时存活率;*,P<0.01,学生测试;n个=每个基因型6个;与D.(F)运动神经元细胞计数相同的动物在无神经元的情况下切断神经后31天的存活率没有下降Ret公司比较对照动物和突变动物时(n个=每个基因型6个;与四个实验队列的D和E(G)WHM RI中的动物相同。GDNF和Artemin治疗可部分改善受伤者的功能恢复六月ΔSC老鼠。*,方差分析和事后Tukey检验P<0.05。六月飞行/飞行GDNF和Artemin对小鼠的治疗效果不明显(P=0.49)。组大小:n个= 10六月飞行/飞行+盐水,n个=2六月飞行/飞行+总会计师。,n个= 5六月ΔSC+盐水,以及n个= 8六月ΔSC+G.A.小鼠。(H) GDNF和Artemin治疗也显著改善了六月ΔSC老鼠。该图显示了使用与G中相同的动物的FG标记的面部运动神经元的轴切与对侧比率。与G中一样,神经营养素治疗并没有显著改善G中的靶神经再支配六月飞行/飞行小鼠(事后Tukey试验中P=0.78)。(一) 运动神经元细胞总数显示,运动神经元存活率仅在六月ΔSC小鼠神经切断后31天。集团规模(G–I):n个= 6六月飞行/飞行+盐水,n个= 3六月飞行/飞行+总会计师。,n个= 5六月ΔSC+盐水,以及n个= 8六月ΔSC+G.A.小鼠。棒材:(A;也适用于B)低放大率,200µm;高倍率插件,100µm。

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引用人

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