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.2012;7（6）：e39646。
doi:10.1371/journal.pone.0039646。 Epub 2012年6月21日。

NGAL/lipocalin-2对MMTV-PyMT/FVB/N小鼠乳腺癌模型肿瘤侵袭性无影响

伊丽莎白·P·克莱默 1, 安德烈亚斯·格伦瑟, 马蒂亚斯·哈格, 安娜·容克-詹森, 拉尔斯·H·恩格尔霍姆, 埃里克·桑托尼·鲁古, 莱夫·伦德, 奥勒·德莱姆, 杰克·考兰德, 尼尔斯·博雷加德
附属机构

NGAL/lipocalin-2对MMTV-PyMT/FVB/N小鼠乳腺癌模型肿瘤侵袭性无影响

伊丽莎白·P·克莱默等。 公共科学图书馆一号. 2012.

摘要

NGAL/lipocalin-2是一种铁载体结合蛋白，在多种癌症中高度表达。有人建议赋予癌细胞增殖优势。在患者和小鼠乳腺癌模型中，其表达与乳腺癌的侵袭性相关。这一点最近在野生型和脂蛋白-2缺乏小鼠的自发乳腺癌小鼠模型中得到证实。我们使用了类似的策略，使用了不同的小鼠菌株。将脂多糖-2缺乏小鼠和小鼠乳腺肿瘤病毒-多瘤中间T抗原（MMTV-PyMT）小鼠杂交到相同的FVB/N背景中。到第8周，所有小鼠都发生了肿瘤。第13周处死小鼠，对组织进行生化和组织学分析。对26只脂蛋白-2缺乏小鼠和34只野生型对照小鼠的肿瘤总体积和转移数量进行了量化。通过实时定量PCR和免疫组织化学方法评估MMTV-PyMT-阳性和野生型小鼠肿瘤中Lipocalin-2的表达。实时PCR定量了脂蛋白-2受体24p3R和megalin以及Mmp-9、转铁蛋白受体和Bdh2（哺乳动物铁载体的产生者）的表达。野生型和脂蛋白-2缺乏小鼠之间未观察到显著差异。Lipocalin-2在野生型小鼠肿瘤中高表达，但表达与肿瘤大小无关。在肿瘤出现的时间、肿瘤总体积或转移的数量方面没有观察到脂运载蛋白-2的影响。野生型和脂蛋白-2缺乏小鼠乳腺肿瘤的组织学和凝胶溶解活性并没有差异。我们得出结论，NGAL/lipocalin-2并不一定会影响小鼠模型中评估的乳腺癌的侵袭性，因此质疑了lipocalin-2在癌症发展中的作用。

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数字

图1
图1。乳腺肿瘤的组织学特征。
A、 C，E，免疫组织化学染色法检测（A）乳腺肿瘤中脂蛋白-2的表达PyMT，Lcn2+/+鼠标，（C）PyMT，Lcn2−/−和（E）PyMT，Lcn2+/+小鼠作为阴性对照，不添加一级抗体。B、 乳腺肿瘤中MMP-9的D、F、免疫组化染色（B）PyMT，Lcn2+/+鼠标，（D）PyMT，Lcn2−/−和（F）PyMT，Lcn2+/+小鼠作为阴性对照，不添加一级抗体。原始放大倍数x600。G、 肿瘤的H+E染色PyMT，Lcn2+/+转移体积最大的小鼠。F、 肿瘤的H+E染色PyMT，Lcn2−/−小鼠代表最大的转移体积。在G和F细胞中均可见具有大量有丝分裂的强烈非典型肿瘤细胞，并被纤细的胶原组织束包围。原始放大倍数x630。缩写：PyMT：MMTV-PyMT.
图2
图2。乳腺肿瘤的典型免疫组化染色。
A、 E-cadherin染色PyMT，Lcn2+/+鼠标。B、 E-钙粘蛋白染色PyMT，Lcn2−/−鼠标。C、 α-SMA染色PyMT，Lcn2+/+鼠标。D、 α-SMA染色PyMT，Lcn2−/−鼠标。E、 波形蛋白染色PyMT，Lcn2+/+鼠标。F、 波形蛋白染色PyMT，Lcn2−/−鼠标。原始放大倍数x400。缩写：PyMT:MTV PyMT公司α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白。
图3
图3。原发性肿瘤的生长PyMT公司,液化天然气2+/+和PyMT公司,液化天然气2−/−小鼠。
A中，液化天然气2-缺乏对肿瘤发病没有影响。数据显示的是Kaplan-Meier图显示的指定周内未发现乳腺肿瘤的小鼠百分比。曲线在统计学上无显著差异，对数秩检验，p = 0.57（牛顿 = 33用于PyMT，Lcn2+/+和n = 25人PyMT，Lcn2−/−）。B、 乳腺肿瘤总体积与年龄的平均值。两者之间无统计学显著差异PyMT，Lcn2+/+和PyMT，Lcn2第13周的−/−小鼠，对数转换后的t检验，p = 0.21（牛顿 = 29用于PyMT，Lcn2+/+和n = 19用于PyMT，Lcn2−/−). C、 通过第10周触诊确定每只小鼠的肿瘤阳性腺体数量，所有小鼠中第一只出现乳腺肿瘤阳性。在肿瘤阳性乳腺中无显著差异，Mann-WhitneyU型-试验，P = 0.85（牛顿） = 33用于PyMT，Lcn2+/+和n = 25人PyMT，Lcn2型−/−). 水平条表示中间带。缩写：PyMT：MMTV-PyMT.
图4
图4。转移瘤生长PyMT公司,液化天然气2+/+以及PyMT公司,液化天然气2−/−小鼠。
利多卡因-2缺乏对总体积无统计学显著影响（t检验，p = 0.09）或数量（t检验，p = 0.09）的原发性乳腺肿瘤肺转移（n = 33用于PyMT，Lcn2+/+和n = 26人PyMT，Lcn2型−/−). A、 肺转移瘤体积PyMT公司,液化天然气2+/+和PyMT，Lcn2−/−小鼠。0处的点表示小鼠没有转移。B、 年肺转移瘤总数PyMT，Lcn2+/+和PyMT公司,液化天然气2−/−小鼠。水平条表示中间带。缩写：PyMT：MMTV-PyMT.
图5
图5。乳腺肿瘤/腺体中mRNA水平的定量实时PCR分析。
每个标记物的表达水平与肿瘤中发现的值相关PyMT，Lcn2+/+mice，其值为1。循环阈值（Ct）PyMT，Lcn2+/+每个标记表达量最高的小鼠为：Lcn2（Ct = 20） ，Mmp-9（Ct = 34），24p3R（Ct = 28）、Tfrc（Ct = 27）和Bdh2（Ct = 35). 的数据PyMT，Lcn2+/+和PyMT，Lcn2−/−小鼠是九只小鼠在肿瘤中的平均表达（每只小鼠测量三次）。的数据液化天然气2+/+和液化天然气2−/−小鼠分别代表两只小鼠在乳腺中的平均表达（每只测量三份）。垂直误差条表示标准偏差。缩写：PyMT：MMTV-PyMT.
图6
图6。酶联免疫吸附试验（ELISA）分析血浆利波卡林-2（p-LCN2）。
第13周乳腺肿瘤的总体积与第13周的p-LCN2之间没有线性回归关系PyMT公司,液化天然气2+/+小鼠，p = 0.68（n = 27).PyMT，Lcn2+/+用圆点和液化天然气2+/+老鼠用正方形表示。实线表示最佳拟合线，虚线表示95%置信区间。缩写：PyMT：MMTV-PyMT.
图7
图7。外周血人类粒细胞、脾脏小鼠粒细胞和肿瘤提取物的Western blot。
脂蛋白-2（LCN2）不能与MMP-9在小鼠中形成异二聚体。与小鼠骨髓细胞相比，肿瘤中LCN2的翻译后修饰没有差异。A、 在非还原条件下分析的样品。在人类中发现了LCN2:LCN2和MMP-9:MMP-9同型二聚体以及LCN2:MMP-9异二聚体。此外，还可以看到MMP-9单体。相反，在小鼠中未观察到LCN2和MMP-9之间的异二聚体，仅观察到LCN2单体以及MMP-9的单体和二聚体形式。B、 在还原条件下分析样品。二硫键断裂后，LCN2:MMP-9异二聚体以及LCN2:LCN2和MMP9:MMP9同源二聚体不再可识别。在人类和小鼠中仅鉴定出LCN2单体和MMP-9单体。C、 左侧面板，在非还原条件下分析样品。右侧面板，减少条件。在这两种条件下，只鉴定出LCN2单体，不鉴定出异二聚体。D、 左侧面板，在非还原条件下分析样品。MMP-9单体可见，在一些肿瘤中甚至发现了同型二聚体。右侧面板，减少条件。MMP-9单体与未知来源的高分子量（HMW）带一起出现。HMW波段在两者中都可见PyMT，Lcn2+/+和PyMT，Lcn2−/−因此不可能是脂蛋白-2:MMP-9异二聚体。所有污渍均以全长尺寸显示。按照图8中C和D的相同顺序加载样本。缩写：WT和KO肿瘤：来自PyMT，Lcn2+/+或PyMT，Lcn2−/−小鼠。Gr-1+：从两只FVB/N小鼠脾脏中纯化的Gr-1阳性细胞。
图8
图8。MMP-9活性明胶酶谱。
两种药物的凝胶溶解活性没有差异PyMT，Lcn2+/+和PyMT，Lcn2−/−肿瘤或血浆中的小鼠。A、 肿瘤的酶谱PyMT，Lcn2+/+（重量）和PyMT，Lcn2以纯化人MMP-9（hMMP-9）为标准的−/−（KO）小鼠。B、 WT和KO小鼠血浆酶谱图以及人血浆和分子量标准。按照图7 C和D中的顺序装载小鼠的肿瘤和血浆样品。
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