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.2012;8（6）：e1002769。
doi:10.1371/journal.pgen.1002769。 Epub 2012年6月21日。

黑腹果蝇早期胚胎中Rel和Smad蛋白对CBP共激活物的优先基因组靶向

Per-Henrik Holmqvist公司 1, 安·博伊亚, 菲利普, 菲利普·克罗纳, 佩尔·斯坦伯格, 马蒂亚斯·曼内维克
附属公司

Rel和Smad蛋白在果蝇早期胚胎中对CBP共激活物的优先基因组靶向作用

Per-Henrik Holmqvist公司等。 公共科学图书馆-基因. 2012.

摘要

CBP和相关p300蛋白是后生动物中广泛使用的转录共激活物，与多种转录因子相互作用。CBP/p300是否与所有因子同等占据基因组，或优先与某些因子结合尚不清楚。因此，我们将果蝇CBP（nejire）ChIP-seq峰与早期胚胎中40种不同转录因子结合的区域进行了比较，发现与Rel-family蛋白Dorsal高度共现。胚胎中CBP的占据需要背侧，但只有在其他因素很少存在的区域才需要背侧。无背核突变体胚胎中的CBP峰值与TGF-ß/Dpp-signaling和Smad-protein结合最相关。突变胚胎中CBP占有率的差异反映了全基因组的基因表达变化，但CBP也占有一些未表达的基因。沉默基因中CBP的存在不会导致组蛋白乙酰化。我们发现多梳重表达的H3K27me3染色质并不排除CBP结合，但限制组蛋白在CBP结合基因组位点的乙酰化。我们得出结论，果蝇胚胎中CBP的占有优先与控制背腹模式的因素重叠，并且CBP结合沉默基因而不会导致组蛋白高乙酰化。

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数字

图1
图1。在早期，CBP和Dorsal比39种其他转录因子更广泛地共占基因组果蝇属胚胎。
A） CBP峰值重叠百分比果蝇属2-4小时胚胎中300个区域在相似的发育阶段被转录因子占据最为强烈。通过增加截止值来选择峰，以便所有CBP峰用于比较x轴上最左边的值，增加截止值会导致沿x轴的峰更少，但更强。请注意，一个因子的长结合区域可以重叠几个CBP峰值。40种转录因子中只有7种显示出来。CBP峰与Dorsal束缚区的重叠程度大于其他因素。B） 7种转录因子的300个最强区域的重叠百分比，野生型中的3013个CBP峰值和1939个Dorsal不能进入细胞核的突变胚胎中的峰值(gd公司7). 在野生型中，Dorsal结合区与CBP峰值的重叠程度优于其他因素。C） 丧失CBP占有率的基因组区域gd公司7突变胚胎（n = 191）与野生型胚胎中40个转录因子的所有峰值进行比较。有因子用红色表示，无因子用黑色表示。仅显示重叠>5%的因子。Dorsal与76%的CBP入住率下降的地区绑定gd公司7胚胎。D） Dorsal可以与来自野生型胚胎的CBP共同免疫沉淀。CBP抗体和对照免疫球蛋白G（IgG）用于2-4小时龄胚胎提取物的免疫沉淀，在凝胶上与10%的输入物分离，并用Dorsal抗体进行探测。部分Dorsal与CBP相关。
图2
图2。CBP与Dpp靶基因结合gd公司7突变胚胎。
A） 2-4小时内CBP峰值重叠百分比gd公司7野生型胚胎中具有300个最强转录因子结合区的突变胚胎。显示了40个因素中的7个。更强的CBP峰与Smad4蛋白Medea结合的区域重叠，Medea是Dpp-signaling的传感器，比任何其他因素都多。B） Dorsal未能进入核gd公司7突变胚胎，导致整个胚胎转化为背外胚层组织，TGF-ß分子Dpp在此发出信号。因此dpp（数据处理程序）展开（ii），Dpp抑制剂的表达索格缺失（iv）和Dpp靶基因的表达乌什扩展（vi）英寸gd公司7突变胚胎与野生型胚胎的比较（i，iii，v）。将2-4小时大的胚胎与地高辛标记的探针杂交，并使其朝向左侧前方。背向上的侧视图如（i）和（ii）所示，腹侧视图如（iii）和（iv）所示；背向视图如（v）和（vi）所示。C） CBP和Medea在乌什基因座，一个Dpp靶基因。野生型（wt）和gd公司7图中显示了突变胚胎以及美狄亚ChIP-ChIP的wt峰值。占用率绘制为对数2-在输入上折叠富集。D） ChIP-qPCR确认CBP入住率在乌什基因座gd公司7胚胎（T试验第页 = 0.045). CBP占有率绘制为相对于米-2轨迹。在两个基因间位点检测到背景占用水平，并绘制平均值（IG）。平均倍数富集和6（wt）或5的标准偏差(gd公司7)显示了独立的生物复制。
图3
图3。CBP峰值可以根据其变化进行分类gd公司7胚胎。
CBP峰值gd公司7从野生型胚胎中计算每个CBP结合区内的胚胎。向上和向下表示CBP占用率变化超过2倍的区域，不变的是变化小于2倍的地区。在以下地区gd公司7峰值低于对数富集度的0.5倍2根据比例尺，CBP被视为丢失。A） 每种类别的峰值数量，与高占用率目标（HOT）区域的重叠，平均HOT，以及对数中野生型CBP峰值输入的平均折叠富集2比例尺。B） 折叠变换（原木2)在美国海关与边境保护局入住期间gd公司7和野生型绘制对比热度。正方形表示平均热度，胡须对应95%的置信区间。美国海关与边境保护局入住率较低gd公司7与野生型相比，该地区的热度较低。C–E）gd公司7Up以蓝色显示，Unchanged以红色显示，Down以绿色显示，Lost以紫色显示。C） 四类CBP峰值的重叠百分比与野生型胚胎中每个转录因子的300个最强结合区域重叠。CBP峰值的三个截止值是：；1） 无截止值（包括所有区域），2）截止值1和3的平均值，3）对应于每个类别野生型胚胎中～5%最富集峰的最高截止值。D） 0-4小时胚胎中四类CBP峰值与组蛋白修饰的重叠百分比（2-4小时胚胎的H3K18ac）。切口如C）所示。E） 四类CBP峰值与基因特征的重叠百分比。显示了启动子（转录起始位点+/-500 bp，TSS）、内含子和基因间区域。不到3%的峰重叠编码区域和3′UTR，因此未显示。与5′UTR重叠可能是由于启动子中靠近TSS的CBP结合所致，不包括在内。基因组覆盖率显示了每个基因特征在基因组中的常见程度，并以浅蓝色显示。F） 与四类CBP相关的基因的平均表达在胚胎发育的不同阶段达到峰值。每个峰值与最近的TSS相关，分析中包含相应基因的表达。日志2根据发育时间点（0–2小时胚胎（E00-02）等）绘制转化表达值。晶须对应95%的置信区间。箭头指向2-4小时大的胚胎中的表达。
图4
图4。野生型和gd公司7突变胚胎与基因表达的平均变化相关。
A） 野生型和gd公司7将突变胚胎（细胞核内无Dorsal）与已发表的管突变胚胎（细胞核内无Dorsal）与伤亡人数10亿突变胚胎（在所有细胞核中都有高水平的Dorsal）。平方表示管与伤亡人数10亿突变胚胎和胡须对应95%的置信区间。在CBP占用率增加至少2倍的基因中，存在转录的平均上调gd公司7突变胚胎(gd公司7向上），以及CBP占用率减少或损失时表达式中的平均减少。未改变区域的平均表达量略有下降是由于CBP占用率在gd公司7未更改组。B） 在gd公司7突变胚胎，背中胚层靶基因的CBP占有率平均下降（在管和gd公司7)以及背外胚层Dorsal靶基因的CBP占有率平均增加（在管和gd公司7)观察到。中胚层和外胚层目标在中定义。方形表示平均CBP结合gd公司7与野生型胚胎相比，胡须对应95%的置信区间。
图5
图5。中胚层Dorsal靶基因的CBP占有率并不总是与Dorsal占有率或基因表达的变化相关。
A和F）现场地高辛标记杂交扭曲(两倍)和蜗牛(国家统计局)RNA探针在2-4小时龄的野生型和突变胚胎中，改变Dorsal蛋白梯度，导致整个胚胎转化为背外胚层、神经外胚层或中胚层。胚胎的方向是左前方，背向上。B和G）野生型（wt）和gd公司7突变胚胎（未切断的原始数据），以及野生型Dorsal ChIP-ChIP峰两倍和国家统计局基因座。占用率绘制为对数2-在输入上折叠富集。C–E和H–J）CBP、Dorsal、H3K9ac、H3K18ac、H3K27ac和H4ac以及Dorsal靶基因处的H3K27me3和H3K9me3的ChIP-qPCR两倍和国家统计局野生型和突变型胚胎。占有率绘制为相对于两个阴性对照位点（基因间区域）平均值的富集，组蛋白乙酰化与组蛋白H3占有率标准化。对每个基因型的2-7个独立生物复制品进行ChIP。误差条表示标准偏差，见T检验结果。在两倍基因座，CBP占有率的变化紧随着Dorsal占有率和基因表达的变化，而在国家统计局位点，CBP占有率独立于Dorsal和基因表达。
图6
图6。CBP对Dorsal抑制基因的组蛋白乙酰化受神经外胚层中H3K27me3的限制。
A和F）现场地高辛标记杂交托洛德(热释光剂量)和泽克纽特(禅宗)RNA探针在2-4小时龄的野生型和突变胚胎中改变Dorsal蛋白梯度。胚胎的方向是左前方，背向上。背索蛋白被转化为热释光剂量和禅宗Dorsal-binding位点的表达两侧是富含AT-的元素，它们结合辅因子并招募Groucho辅阻遏物。B和G）野生型（wt）和gd公司7突变胚胎（未切断的原始数据），以及野生型Dorsal ChIP-ChIP峰热释光剂量和禅宗基因座。占用率绘制为对数2-在输入上折叠富集。C–E和H–J）CBP、Dorsal、H3K9ac、H3K18ac、H3K27ac和H4ac的ChIP-qPCR，以及H3K27me3和H3K9 me3在热释光剂量和禅宗野生型和突变型胚胎。占用率如图5所示。误差条表示标准偏差，参见T测试结果。在伤亡人数9元/10元突变胚胎，在热释光剂量和禅宗尽管CBP在很大程度上结合。这些胚胎中高水平的H3K27三甲基化可能会限制CBP和其他HAT的组蛋白乙酰化。
图7
图7。CBP可在果蝇属胚胎。
A） 果蝇属胚胎沿着其前后轴分为几段，而不同的胚层沿着背腹轴出现。CBP在全基因组中的占有率在背腹侧模式中的两个关键形态因子（Toll/dorsal和Dpp/Medea）的靶点上表现过高。相比之下，前-后激活物（如Bicoid和Caudal）在较小程度上重叠了CBP的基因组分布。B） 不同组织中Dorsal靶基因的组蛋白修饰、Dorsal和CBP占有率综述。所测试的四种组蛋白乙酰化反应的平均值为绿色和H3K27三甲基化蓝色，CBP为红色和Dorsal（dl）淡蓝色。球体的大小代表蛋白质/组蛋白修饰的丰度，并按比例绘制。背侧抑制热释光剂量和禅宗与格鲁乔（Gro）一起，而塞尔达（Zelda）和其他可能的因素（？）激活了这些基因。尽管CBP结合与全基因组的基因表达和Dorsal结合有关，但CBP也可以与沉默基因有关。沉默的CBP结合基因未被激活的一个原因可能是H3K27me3抑制的染色质限制组蛋白乙酰化。
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