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.2012年7月1日；11(13):2545-56.
doi:10.4161/cc.20920。 Epub 2012年7月1日。

二室肿瘤代谢：肿瘤微环境中的自噬和癌细胞中的氧化线粒体代谢

艾哈迈德·萨勒姆 1, 戴安娜·惠特克-梅内泽斯, 赵琳, Ubaldo E Martinez-Outschoorn公司, 赫伯特·B·塔诺维茨, Mazhar Salim Al-Zoubi公司, 安东尼·豪威尔, 理查德·佩塞尔, 费德里卡·索蒂亚, 迈克尔·P·利桑蒂
附属公司

二室肿瘤代谢：肿瘤微环境中的自噬和癌细胞中的氧化线粒体代谢

艾哈迈德·塞勒姆等。 细胞周期. .

摘要

此前，我们提出了一种新的范式来解释自噬在肿瘤代谢中的区域特异性作用。在这个模型中，肿瘤基质中的自噬和线粒体功能障碍促进了细胞分解代谢，从而产生循环营养物质。这些化学构件和高能“燃料”将通过癌细胞的自噬抵抗和氧化线粒体代谢，驱动肿瘤的合成代谢生长。我们将这种新形式的间质-上皮代谢耦合称为“双室肿瘤代谢”。在这里，我们通过基因创造（1）具有线粒体功能障碍的自噬成纤维细胞或（2）具有线粒体功能增强的自噬性癌细胞，严格验证了这种能量转移假说。自噬成纤维细胞是通过稳定地过度表达导致AMP激酶活化的关键靶基因（如DRAM和LKB1）而产生的。抗自噬癌细胞是通过过度表达GOLPH3而获得的，GOLPH4在功能上促进线粒体的生物发生。正如预测的那样，DRAM和LKB1过表达的成纤维细胞是组成性自噬的，并有效促进肿瘤生长。我们证实自噬成纤维细胞表现出线粒体功能障碍，线粒体燃料的产生增加（L-乳酸和酮体积累）。相反，GOLPH3过度表达的乳腺癌细胞具有自噬抗性，并显示线粒体生物发生和功能增加的迹象，从而导致肿瘤生长增加。因此，肿瘤基质中的自噬和癌细胞中的氧化线粒体代谢（OXPHOS）都可以显著促进肿瘤生长，而与肿瘤血管生成无关。我们目前的研究首次将肿瘤微环境中的DNA损伤反应与“Warburg-like”癌症代谢联系起来，因为DRAM是一种DNA损伤/修复靶基因。

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数字

无
图1。DRAM过度表达的成纤维细胞显示了自噬的诱导：免疫植物学。用编码DRAM的慢病毒载体或单独的载体对照（Lv-105）转导hTERT-BJ1永生化的人成纤维细胞。在筛选出对嘌呤霉素的耐药性后，使用稳定的成纤维细胞系制备蛋白裂解物，然后用特异性抗体探针进行免疫印迹分析。（A） 免疫印迹分析验证了DRAM的表达。（B）注意，四个自噬标记物（BNIP3、Beclin1、LAMP1和Cathepsin B）均在DRAM表达的反应中上调，与自噬的诱导一致。在面板A和B中，使用β-肌动蛋白的免疫印迹显示为蛋白质负载相等的对照。
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图2。DRAM过度表达的成纤维细胞显示了自噬的诱导：共培养期间的免疫荧光。DRAM过度表达的成纤维细胞或相应的单独载体对照成纤维细胞（Lv-105）与MDA-MB-231-GFP+细胞（绿色）共培养3天。注意，免疫荧光显微镜（RED；白色箭头所示）显示，DRAM表达的成细胞清楚地显示自噬标记物（LAMP1和Beclin1）的表达增加。通过使用Hoechst-33258（蓝色）进行反击训练来观察细胞核。
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图3。DRAM激活成纤维细胞的自噬，导致Cav-1蛋白表达的丢失。注意，DRAM过度表达的成纤维细胞也显示出Cav-1表达的丢失，正如预测的那样，可能是由于自噬的诱导。用β-肌动蛋白进行免疫印迹显示为蛋白质载量相等的对照。
无
图4。DRAM激活成纤维细胞的自噬，导致线粒体功能障碍。（A） OXPHOS免疫印迹。鉴于BNIP3（有丝分裂的标志物）的上调，我们还研究了线粒体OXPHOS（复合物I-V）的状态。注意，DRAM过度表达的成纤维细胞显示OXPHOS复合物I、III和IV的组分显著减少，与有丝分裂表型一致。用β-肌动蛋白进行免疫印迹显示为蛋白质载量相等的对照。（B） L-乳酸的产生。hTERT成纤维细胞以1×10的细胞密度在12孔培养皿中完全培养5成纤维细胞/孔。第二天，将培养基更换为添加2%FBS的新鲜DMEM。48小时后，收集培养基，并根据制造商的方案，立即使用EnzyChrom L-乳酸检测试剂盒（BioAssay，Inc.）检测L-乳酸。然后用血细胞仪对细胞进行清洗、胰蛋白酶化和计数。值得注意的是，过表达DRAM的成纤维细胞在组织培养基中的L-乳酸盐积累增加了3倍以上。（C和D）酮生产。hTERT成纤维细胞在12孔培养皿中以1 x 10的细胞密度在完全培养基中培养5成纤维细胞/孔。第二天，将培养基更换为添加2%FBS的新鲜DMEM。72小时后，收集培养基，并根据制造商的方案，立即使用β-羟基丁酸（β-HB）检测试剂盒（Biovision，Inc.）对酮进行检测。或者，通过添加添加40 mM HEPES的温热HBSS使细胞饥饿6小时。饥饿后，收集HBSS并测量酮类。用血细胞仪对细胞进行清洗、胰蛋白酶化和计数。请注意，DRAM过度表达的成纤维细胞在组织培养基（C）中的酮体积累量增加了3倍以上，饥饿（D）进一步加剧了这种影响。
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图5。DRAM过度表达的成纤维细胞显示AMP激酶激活。线粒体功能障碍导致AMP水平升高（由于ATP降低），因此，我们检查了AMP激酶的激活状态。注意，在DRAM过度表达的成纤维细胞中，AMP激酶确实过度激活，这与线粒体功能的丧失一致。用β-肌动蛋白进行免疫印迹显示为蛋白质载量相等的对照。
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图6。DRAM过度表达的成纤维细胞可以促进肿瘤生长，而血管生成没有显著增加。（A） 将DRAM过度表达的成纤维细胞与乳腺癌细胞（MDA-MB-231-GFP+）共同注射到裸鼠侧翼。注射后4周，在DRAM成纤维细胞存在下生长的肿瘤显示肿瘤生长增加了约2倍（根据肿瘤重量或体积测量）。p值如图所示。n=10/实验组。（B） 虽然用DRAM成纤维细胞生长的肿瘤显示CD31-阳性血管密度略有增加（约18%），但这种微小差异不能解释所观察到的肿瘤生长增加2倍的原因。因此，我们的数据更符合这样的假设，即肿瘤基质中的分解代谢可以通过基质-上皮代谢耦合“刺激”癌细胞的合成代谢生长。
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图7。LKB1激活成纤维细胞中的AMP激酶，导致自噬的发生。为了确定基质成纤维细胞中AMP-激酶的激活是否足以促进肿瘤生长，我们生成了过度表达野生型LKB1的hTERT-BJ1成纤维细胞。作为关键阴性对照，我们还生成了过表达激酶缺失（KD）形式的LKB1（K78I）或单纯载体对照（pBABE-puro）的匹配成纤维细胞系。（A） 注意，尽管KD-突变株（K78I）表现出较高的稳态表达水平，但两种形式的LKB1（WT和KD）在hTERT-BJ1成纤维细胞中都有良好的表达。（B） 免疫印迹分析显示，野生型LKB1通过磷酸特异性抗体探针在功能上诱导AMP激酶磷酸化的激活。（C） 野生型LKB1足以上调自噬标记（如BNIP3和LC3-I/II）。在面板A-C中，使用β-肌动蛋白的免疫印迹显示为相等蛋白质负载的对照。
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图8。LKB1-介导的癌相关成纤维细胞AMP-激酶激活促进自噬并促进肿瘤生长。为了确定具有组成性AMP-激酶激活的自噬成纤维细胞是否能够促进肿瘤生长，将LKB1过度表达的成纤维细胞与MDA-MB-231-GFP+细胞共同注射到裸鼠的侧翼。正如预测的那样，过度表达野生型（WT）LKB1的自噬成纤维细胞显著促进肿瘤生长（约2倍），而表达激酶死亡（KD）LK1的成纤维细胞则显著抑制肿瘤生长（2.5倍以上）（A和B）。p值如图所示。n=10/实验组。（A） 注射后3.5周显示肿瘤生长（体积）的时间进程。（B） 注射后第25天肿瘤切除后显示肿瘤生长（重量和体积）。（C） 通过CD31免疫染色测量，肿瘤生长的这些显著变化与新生血管形成的大幅增加或减少无关，排除了血管生成是主要原因。
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图9。成纤维细胞中AMP激酶亚型的过度表达不足以促进肿瘤生长。将AMP-激酶过表达的成纤维细胞与MDA-MB-231-GFP+细胞共同注射到裸鼠侧翼。注意，仅在hTERT成纤维细胞中重组表达AMP-激酶亚型（AMPKα1或α2）不足以促进肿瘤生长。因此，由LKB1介导的AMP-激酶激活是增强肿瘤生长所必需的。研究了AMPKα1两种不同亚型表达的功能效应（559个氨基酸对574个氨基酸）。NS，不显著。n=10/实验组。
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图10。GOLPH3在乳腺癌细胞中的过度表达导致mTOR激活和自噬抵抗。我们在MDA-MB-231乳腺癌细胞中过度表达GOLPH3，以检测其对mTOR激活和自噬抵抗的功能影响。（A） 注意，GOLPH3在MDA-MB-231细胞中成功稳定表达，这是使用针对HA-epitope标签的抗体检测到的。（B） 在基底细胞培养条件下，GOLPH3激活mTOR超磷酸化和组织蛋白酶B表达缺失。（C） 在饥饿条件下[HBSS（40 mM HEPES，pH 7.2，Hank’s Balanced Salt Solution）中4小时]，GOLPH3产生自噬抵抗，表现为BNIP3和LC3-I/II表达缺失。在面板A-C中，使用β-肌动蛋白的免疫印迹显示为相等蛋白质负载的对照。
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图11。GOLPH3过度表达促进乳腺癌细胞线粒体生物发生，促进合成代谢肿瘤生长。（A） MDA-MB-231细胞中GOLPH3过度表达使MitoTracker染色增加了2倍以上，与线粒体生物发生和/或功能增加一致。（B） 我们将过表达的GOLPH3 MDA-MB-231细胞注射到裸鼠的侧翼。注射后4周，与单纯载体对照组相比，GOLPH3肿瘤的生长增加了3倍。p值如图所示。n=10/实验组。（C） CD31免疫染色显示，血管生成没有显著增加。
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图12。自噬和二室肿瘤代谢：定义DRAM、LKB1和GOLPH3的作用。DRAM和LKB1激活癌相关成纤维细胞中的AMP激酶，导致自噬、有丝分裂和线粒体功能障碍。相反，癌细胞中GOLPH3的表达可能通过诱导线粒体生物发生或增强线粒体功能来介导自噬抵抗。因此，自噬的室特异性调节导致间质-上皮代谢耦合的“寄生”形式。羟基氯喹；RA，雷帕霉素类似物。氯喹和雷帕霉素类似物都可以通过同时开启或关闭两个细胞区（癌细胞和基质成纤维细胞）的自噬，在功能上破坏代谢偶联。CAF，癌相关成纤维细胞。
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