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.2012年6月26日；109(26):10388-93.
doi:10.1073/pnas.1205210109。 Epub 2012年6月11日。

内耳血管周围的巨噬细胞样黑素细胞对纹状体内流体-血液屏障的完整性至关重要

张文静 1, 民代, 安德斯·弗里德伯格, 队长哈山, 杰奎琳·德加涅, 玲玲能, 张飞（音译）, 何文轩, 任天英, 丹尼斯·特鲁恩, 曼弗雷德·奥尔, 史晓瑞
附属公司

内耳血管周围的巨噬细胞样黑素细胞对纹状体内流体-血液屏障的完整性至关重要

张文静等。 美国国家科学院程序. .

摘要

耳蜗的微环境是由体循环和血管纹内液体之间的屏障维持的。然而，控制纹内液体-血液屏障通透性的机制尚不清楚。屏障由内皮细胞组成，内皮细胞通过紧密连接和基底膜相互连接。在最近的一项研究中，我们发现试验内液体血液屏障还包括大量具有巨噬细胞和黑素细胞特征的血管周细胞。血管周围巨噬细胞样黑素细胞（PVM/M）通过细胞质突起与血管密切接触。在此，我们证明PVM/Ms在维持脑内液-血屏障和听力功能的完整性方面具有重要作用。使用基于细胞培养的体外模型和基因诱导的PVM/M缺失动物模型，我们表明，缺少PVM/M会增加纹状体内液-血屏障对低分子量和高分子量示踪剂的渗透性。通透性增加是由色素上皮衍生因子表达减少引起的，该因子调节一些紧密连接相关蛋白的表达，有助于屏障的完整性。当对内耳电位和听觉脑干反应进行测试时，PVM/M缺失动物的内耳电位显著下降，伴有听力损失。我们的结果表明，PVM/Ms在调节纹状体内液-血屏障的通透性以建立正常的耳蜗内电位听阈方面发挥着关键作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
被鉴定为黑素细胞样巨噬细胞的血管周围驻留细胞通过细胞质过程与毛细血管密切接触。(A类)SV.PVM/Ms的三维共焦重建图像用F4/80抗体标记（白色），细胞骨架用指骨蛋白标记（红色）。PVM/M夹在SV的边缘层（MC）和基底层（BC）之间(B)不同角度的3D重建图像显示PVM/M位于上皮下边缘细胞内或其下方(左侧)与基底细胞接触较少(赖特). (C类和D类)概述(C类)和近景(D类)共聚焦堆栈的3D渲染显示了PVM/M与内皮管接口的分支过程。毛细血管上标记有IV型胶原抗体(E类)PVM/Ms含有黑色素颗粒（箭头）。(F类)全山SV中F4/80（绿色）、GSTα4（蓝色）和毛细血管（红色）的三重标记显示PVM/Ms表达GSTα4。(G公司)整体SV中F4/80（绿色）和GST（红色）的双标签显示PVM/M表达GST。（H）)在全安装SV中，F4/80（绿色）和Kir4.1（红色）的双标签显示PVM/Ms表示Kir4.1。(我)mRNA用于Gpf480、Gst、，和基尔4.1通过RT-PCR分析在分离和纯化的PVM/Ms中检测到。(J型和K（K）)原代培养的PVM/M被标记为GST（红色）或GST4a（红色）、F4/80（绿色）和细胞核（蓝色）的三重标记。(L（左）)原代培养的PVM/M对F4/80（绿色）和Kir4.1进行双重标记。(M（M）)mRNA用于Gpf480、Gst,Gst4αRT-PCR分析在原代培养的PVM/M中发现Kir4.1。
图2。
图2。
体外EC单层膜一在没有PVM/Ms的情况下更具渗透性。（A）和B）微分干涉对比（DIC）显微镜下原代培养的内皮细胞和PVM/Ms(左侧)在共聚焦荧光显微镜下鉴定标记蛋白vMf（EC）和F4/80（PVM/Ms）(赖特). (C类)EC单层表达紧密连接蛋白ZO-1和闭塞素。(D类和E类)体外模型和实验装置的示意图。(F类)PVM/Ms存在和不存在时单层渗透率的定量分析*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.
图3。
图3。
PVM/Ms的转基因消融导致毛细血管渗漏。(A类)共焦图像显示了之前PVM/M（箭头）的分布(左侧)以及之后(赖特)DT治疗。(B) (左侧)该图描述了DT结合其受体（DTR）导致PVM/Ms耗竭的特征。(赖特)DT治疗5天后，PVM/M人群显著减少**P（P）< 0.01. (C类)PVM/M耗竭导致听力损失(左侧)并加入EP(**P（P）< 0.01) (赖特). (D类)PVM/M消融动物耳蜗侧壁中积累的荧光示踪剂(赖特)但不在对照动物中(左侧). (E–G公司)通过IV型胶原免疫染色（绿色）观察到DT处理小鼠毛细血管中不同大小的示踪剂外渗(左侧)但在对照组小鼠中没有(赖特). 箭头指向示踪剂荧光（红色），该荧光从毛细管中泄漏。(H（H）)低分子量尸体蛋白Alexa Fluor-555的毛细管泄漏(左侧)和高分子量IgG-Alexa568(赖特)在PVM/M消融小鼠中显著，但在对照小鼠中不显著*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.
图4。
图4。
PVM/Ms通过影响紧密连接蛋白的表达来控制屏障完整性。(A类)qRT-PCR显示mRNA闭锁连接蛋白1,闭塞素、和钙黏蛋白PVM/女士在场或不在场*P（P）< 0.05. (B)蛋白质表达的细胞内蛋白印迹分析。(C类)在PVM/Ms存在和不存在的情况下对蛋白质进行定量分析*P（P）< 0.05. (D类)蛋白质的免疫荧光标记。共培养。(E类)从SV分离出毛细血管(上部)孤立毛细血管的DIC图像。(下部)用IV型胶原抗体标记的分离毛细血管(F类)qRT-PCR结果比较闭锁连接蛋白1,闭塞素、和钙黏蛋白在对照和DT处理动物的隔离毛细血管中。(G公司–一）对照组分离毛细血管（DAPI复染，蓝色）中ZO-1（红色）、闭塞素（绿色）和ve-cadherin蛋白（黄色）的免疫荧光标记(左侧)和经DT处理的动物(赖特). (J型–L（左）)PVM/M缺失动物的蛋白质表达显著降低*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.
图5。
图5。
PVM/M对屏障完整性的控制由PEDF介导。(A类)培养PVM/Ms表达PEDF(上部)而内皮细胞表达其受体PEDFR(下部). (B)在4-d PVM/M培养基中生产PEDF。(C类)三个标签的全安装SV显示PEDF(顶部)以PVM/M强烈表达(中部). (底部)融合图像显示毛细管染色与抗体IgG。(D类) (顶部)用IV型胶原抗体标记的分离毛细血管(中部)PEDFR在毛细管壁中表达。(底部)合并的图像。(E类)体外siRNA-转染细胞（绿色）双重标记PVM/M标记蛋白F4/80（红色）和细胞核（DAPI，蓝色）。(F类)qRT-PCR分析显示佩德夫在转染的PVM/Ms中(G公司)qRT-PCR分析显示闭锁连接蛋白1,闭塞素、和钙黏蛋白在siRNA转染、对照和PEDF处理的EC单层中。(H（H）–J型)siRNA-转染、对照和PEDF处理的EC单层中ZO-1、闭塞素和ve-cadherin的细胞内Western blot蛋白分析。(K（K）)共焦和DIC图像显示体内SV中的siRNA转染细胞（绿色）。(L）qRT-PCR显示mRNA表达下调佩德夫体内PVM/Ms。(M（M）–O）siRNA-转染的分离毛细血管中蛋白质的表达(左侧)，矢量控制(居中)和PEDF治疗的PVM/M缺失动物(赖特). (P（P）–R（右）)蛋白质的定量分析*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.
图6。
图6。
PEDF/PEDFR信号通路调节连接蛋白表达的工作模型。毛细血管内皮细胞通过紧密的粘附连接连接，限制相邻细胞之间的细胞旁转运。当PVM/M不存在时，循环大分子从毛细管中溢出。PVM/Ms通过PEDF/PEDFR信号通路影响紧密连接蛋白和粘附连接蛋白的表达，从而控制血管通透性。
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