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.2013年5月；62(5):695-707.
doi:10.1136/gutjnl-2011-301775。 Epub 2012年6月8日。

中间丝蛋白波形蛋白是NOD2活性的调节器

克雷格·斯蒂文斯 1, 德森, 伊莱恩·尼姆, 迪内什·C·索尔斯, 贝尔金·多根, 肯尼思·辛普森, 杰弗里·巴雷特； 国际炎症性肠病遗传学联合会； 大卫·C·威尔逊, 杰克·萨桑吉
附属公司

中间丝蛋白波形蛋白是NOD2活性的调节器

克雷格·斯蒂文斯等。 肠子. 2013年5月.

勘误表in

  • 内脏。2013年5月；62(5):707

摘要

目标：核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2（NOD2）基因的突变仍是克罗恩病（CD）的最强遗传决定因素。在先前确定波形蛋白是一种新的NOD2相互作用蛋白后，作者旨在研究波形蛋白对NOD2功能的调节作用以及波形蛋白变异与CD敏感性的关系。

设计：采用免疫共沉淀、荧光显微镜和分馏技术证实NOD2与波形蛋白之间的相互作用。将稳定表达野生型NOD2或NOD2移码变异体（L1007fs）的HEK293细胞和SW480结肠上皮细胞与波形蛋白抑制剂联合使用，使用核因子κB（NF-κB）报告基因、基于绿色荧光蛋白LC3的自噬、，细菌庆大霉素保护试验。国际全基因组关联荟萃分析数据用于测试Vim中单核苷酸多态性与CD敏感性的关联。

结果：NOD2富含亮氨酸的重复结构域含有波形蛋白结合所需的元素；CD-相关多态性破坏了这种相互作用。NOD2和波形蛋白在细胞质膜共定位，L1007fs和R702W变体的胞浆定位错误与无法与波形蛋白相互作用相关。WFA的使用证明，波形蛋白是NOD2依赖性NF-κB激活和胞壁二肽诱导自噬诱导所必需的，并且NOD2和波形蛋白调节CD-相关粘附-侵袭性大肠杆菌菌株的侵袭和存活特性。遗传分析揭示了包含Vim的单倍型块中的关联信号。

结论：波形蛋白是NOD2功能的重要调节因子，是CD治疗的潜在新靶点。此外，Vim是CD的候选易感基因，支持功能数据。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。波形蛋白作为NOD2相互作用蛋白的鉴定
（a） 在我们的酵母双杂交试验中，波形蛋白和波形蛋白克隆与NOD2结合的结构示意图。（b） 酵母菌株AH109与含有酵母表达载体pGADT7-AD、全长波形蛋白cDNA、野生型NOD2或CD-相关变体NOD2-R702W的质粒共转化，如图所示。在（Leu-Trp-）板上选择共转换物，并在选择性培养基（His-Leu-Trp-）上发现共转换物。（虚线表示删除了不相关车道的位置）。（c） 用HA-NOD2或HA-empty载体转染SW480细胞，并用HA-11特异性抗体或非特异性抗体免疫沉淀提取液作为对照。对沉淀进行相关波形蛋白和NOD2的免疫印迹，以及HA-11和波形蛋白抗体的直接裂解物。（d） 用HA-NOD2或HA-empty载体转染SW480细胞，并用波形蛋白特异性抗体或非特异性抗体免疫沉淀细胞提取物作为对照。对沉淀进行相关NOD2和波形蛋白的免疫印迹，并用HA-11和波状蛋白抗体直接裂解产物。
图2
图2。LRR域包含与波形蛋白结合的主要决定因素
（a） 显示NOD2结构和CD-相关多态性位置的示意图。还显示了通过定点突变产生的缺少LRR域或同时缺少LRR和NACHT（NAIP、CIITA、HET-E和TP1）域的NOD2缺失突变体。（b） 将HA-NOD2或缺失突变体转染到HEK293细胞中，并用波形蛋白特异性抗体免疫沉淀细胞裂解物。对沉淀进行相关NOD2蛋白和波形蛋白的免疫印迹，并用HA-11和波形素抗体直接裂解产物。（c） 用HA-NOD2、HA-NOD2-R702W、HA-NOD2-G908R或HA-NOD2-L1007fs变体转染HEK293细胞，并用波形蛋白特异性抗体免疫沉淀细胞裂解物。对沉淀进行相关NOD2和波形蛋白的免疫印迹，并用HA-11和波状蛋白抗体直接裂解产物。
图3
图3。CD-相关NOD2变体的亚细胞定位
（a） 用HA-NOD2、HA-NOD2-R702W、HA-NOD2-G908R或HA-NOD2-L1007fs变体转染HEK293细胞，并用E-cadherin特异性抗体（绿色）和外源性NOD2用HA-11抗体（红色）进行免疫染色。合并的图像显示NOD2和E-cadherin共存的区域（黄色），并在HA-NOD2和HA-NOD2-G908R细胞中高亮显示（面板d，k）。（b） 图2A中NOD2膜定位的量化。对来自三个不同视野的20个细胞进行膜定位NOD2评估。***=P（P）<0.001. （c） 用HA-NOD2、HA-NOD2-R702W、HA-NOD2-G908R或HA-NOD2-L1007fs变体转染HEK293细胞。转染后，蛋白质被分离成特定的亚细胞组分。对每个组分进行NOD2蛋白、波形蛋白、GAPDH、E-cadherin和组蛋白H1的免疫印迹。（d） 使用密度测定法测定HA-NOD2（i）、HA-NOD2-R702W（ii）、HA-NOD2-G908R（iii）和HA-NOD2-L1007fs（iv）相对于细胞溶质部分的相对蛋白膜分数。Cyt，胞质溶胶；膜，膜。（e） 用HA-NOD2转染HEK293细胞，并用HA-11抗体（红色）波形蛋白特异性抗体（绿色）进行免疫染色。NOD2和vimentin共存的区域高亮显示，并显示为黄色。
图3
图3。CD-相关NOD2变体的亚细胞定位
（a） 用HA-NOD2、HA-NOD2-R702W、HA-NOD2-G908R或HA-NOD2-L1007fs变体转染HEK293细胞，并用E-cadherin特异性抗体（绿色）和外源性NOD2用HA-11抗体（红色）进行免疫染色。合并的图像显示NOD2和E-cadherin共存的区域（黄色），并在HA-NOD2和HA-NOD2-G908R细胞中高亮显示（面板d，k）。（b） 图2A中NOD2膜定位的量化。对来自三个不同视野的20个细胞进行膜定位NOD2评估。***=P（P）<0.001. （c） 用HA-NOD2、HA-NOD2-R702W、HA-NOD2-G908R或HA-NOD2-L1007fs变体转染HEK293细胞。转染后，蛋白质被分离成特定的亚细胞组分。对每个组分进行NOD2蛋白、波形蛋白、GAPDH、E-cadherin和组蛋白H1的免疫印迹。（d） 使用密度测定法测定HA-NOD2（i）、HA-NOD2-R702W（ii）、HA-NOD2-G908R（iii）和HA-NOD2-L1007fs（iv）相对于细胞溶质部分的相对蛋白膜分数。细胞色素，胞浆；膜，膜。（e） 用HA-NOD2转染HEK293细胞，并用HA-11抗体（红色）波形蛋白特异性抗体（绿色）进行免疫染色。NOD2和vimentin共存的区域高亮显示，并显示为黄色。
图4
图4。WFA抑制波形蛋白并将NOD2重新定位到胞浆
（a） HEK293细胞用WFA或DMSO对照处理2小时。然后对细胞提取物进行波形蛋白和肌动蛋白的免疫印迹。（b） 使用台盼蓝排除法评估WFA或DMSO对照组在指定浓度下处理2h的细胞活力。（c） 用WFA（2μM）或DMSO对照处理HEK293细胞2h。然后用波形蛋白特异性抗体对细胞进行免疫染色，并用DAPI联合染色检测细胞核。（d） 转染HA-NOD2的HEK293细胞用WFA（2μM）或DMSO对照处理2h，细胞裂解物用波形蛋白特异性抗体免疫沉淀。对沉淀进行相关NOD2和波形蛋白的免疫印迹，并用HA-11和波状蛋白抗体直接裂解产物。（e） 用HA-NOD2转染HEK293细胞。然后用WFA（2μM）或DMSO对照物处理细胞2小时。处理后的细胞用HA-11抗体进行免疫染色，并用DAPI联合染色以检测细胞核。（f） 图4E中NOD2膜定位的量化。对来自三个不同视野的20个细胞进行膜定位NOD2评估。***=P（P）<0.001.
图5
图5。WFA抑制NOD2依赖性NF-κB信号传导
（a） SW480细胞转染NF-κB-荧光素酶野生型（NF-κB luc-WT）或缺失NFκB结合位点的突变型（NF-kb B-luc-Mut）（200ng）和内部对照肾素（100ng）。16-18小时后，用L18-MDP（1μg/ml）处理细胞6小时，或用TNF-α（50ng/ml）处理2小时，然后采集细胞进行荧光素酶分析。数据来源于三份读数。（b） SW480细胞转染NF-κb-荧光素酶野生型（NF-κb luc-WT）或缺失NFκb结合位点的突变型（NF-kb b-luc-Mut）（200ng）和内部对照肾素（100ng）。16-18小时后，用L18-MDP（1μg/ml）处理细胞6小时，或用TNF-α（50ng/ml）在WFA（2h）或DMSO对照（2h。数据来源于三份读数。*=P（P）<0.05，ns=不显著。
图6
图6。WFA抑制NOD2依赖性自噬
（a） 生成稳定表达FLAG-EMPTY、FLAG-NOD2或FLAG-NOD-L1007fs的HEK293细胞。用NOD2特异性抗体对细胞提取物进行免疫印迹。（b） 用NOD2特异性抗体对稳定表达FLAG-EMPTY、FLAG-NOD2或FLAG-NOD-L1007fs的HEK293细胞进行免疫染色。（c） 和（e）转染稳定表达FLAG-NOD2（c）或FLAG-NOD-L1007fs（e）的HEK293细胞以表达GFP-LC3。细胞用WFA（2μM）预处理30分钟，然后用L18-MDP（50μg/ml）处理8小时。治疗后，通过荧光显微镜（i）和（ii）定量测定每个细胞显示大于五个不同LC3点状自噬体的细胞百分比。对每个样本的5个不同视野中的GFP-LC3阳性细胞进行计数。**=P（P）<0.01（d）和（f）稳定表达FLAG-NOD2（d）或FLAG-L1007fs（f）的HEK293细胞用WFA（2μM）预处理30分钟，然后用L18-MDP（50μg/ml）处理8小时。对细胞提取物进行LC3和肌动蛋白免疫印迹。用密度计测量LC3-II与LC3-I的比值。S/S，血清饥饿。
图6
图6。WFA抑制NOD2依赖性自噬
（a） 生成稳定表达FLAG-EMPTY、FLAG-NOD2或FLAG-NOD-L1007fs的HEK293细胞。用NOD2特异性抗体对细胞提取物进行免疫印迹。（b） 用NOD2特异性抗体对稳定表达FLAG-EMPTY、FLAG-NOD2或FLAG-NOD-L1007fs的HEK293细胞进行免疫染色。（c） 和（e）转染稳定表达FLAG-NOD2（c）或FLAG-NOD-L1007fs（e）的HEK293细胞以表达GFP-LC3。细胞用WFA（2μM）预处理30分钟，然后用L18-MDP（50μg/ml）处理8小时。治疗后，通过荧光显微镜（i）和（ii）定量测定每个细胞显示大于五个不同LC3点状自噬体的细胞百分比。对每个样本的5个不同视野中的GFP-LC3阳性细胞进行计数。**=P（P）<0.01（d）和（f）稳定表达FLAG-NOD2（d）或FLAG-L1007fs（f）的HEK293细胞用WFA（2μM）预处理30分钟，然后用L18-MDP（50μg/ml）处理8小时。对细胞提取物进行LC3和肌动蛋白免疫印迹。用密度计测量LC3-II与LC3-I的比值。S/S，血清饥饿。
图7
图7。NOD2和vimentin调节CD-相关AIEC的侵袭和存活
（a） 采用庆大霉素保护试验评估稳定表达FLAG-EMPTY、FLAG-NOD2或FLAG-NOD-L1007fs的HEK293细胞在使用大肠杆菌应变CUICD541-10或CUH17-1.**=P（P）<0.01, * =P（P）<0.05. （b） 抑制大肠杆菌菌株CUICD541-10或CUH17-1通过用非特异性对照抗体预先培养宿主细胞入侵HEK293细胞，（c）特异性阻断波形蛋白的抗体，（d）WFA或DMSO对照，在2小时后通过庆大霉素保护试验进行评估。***=P（P）<0.001. （e） 评估WFA对大肠杆菌菌株CUICD541-10存活时，允许细菌在用WFA或DMSO对照处理之前侵入稳定表达FLAG-EMPTY或FLAG-NOD2的HEK293细胞。24小时后通过庆大霉素保护试验评估NOD2和WFA对CUICD541-10存活率的影响。**=P（P）<0.01, * =P（P）<0.05.
图7
图7。NOD2和vimentin调节CD-相关AIEC的侵袭和存活
（a） 采用庆大霉素保护试验评估稳定表达FLAG-EMPTY、FLAG-NOD2或FLAG-NOD-L1007fs的HEK293细胞在使用大肠杆菌应变CUICD541-10或CUH17-1.**=P（P）<0.01, * =P（P）<0.05. （b） 抑制大肠杆菌通过将宿主细胞与非特异性对照抗体、（c）特异性阻断波形蛋白的抗体、（d）WFA或DMSO对照预孵育，菌株CUICD541-10或CUH17-1对HEK293细胞的侵袭在2小时后通过庆大霉素保护测定进行评估。***=P（P）<0.001. （e） 评估WFA对大肠杆菌菌株CUICD541-10存活，在用WFA或DMSO对照处理之前，允许细菌侵入稳定表达FLAG-EMPTY或FLAG-NOD2的HEK293细胞。24小时后通过庆大霉素保护试验评估NOD2和WFA对CUICD541-10存活率的影响。**=P（P）<0.01, * =P（P）<0.05.
图8
图8。用1000个基因组参考集输入的7项CD全基因组关联研究的荟萃分析结果
散点图显示163kb区域的−logP值维姆965个单核苷酸多态性。垂直虚线表示维姆基因和实线是每个单倍型块的极限。对应于的−logP值P（P）<0.05用水平（红色）虚线表示。
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