跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

点政府

政府意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息,确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https(https)://确保您连接到官方网站,并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2012年9月;40(16):7676-89.
doi:10.1093/nar/gks509。 Epub 2012年5月30日。

活化巨噬细胞中异染色质蛋白1γ和IκB激酶α在肿瘤坏死因子基因转录延长过程中的相互依赖性

附属公司

激活巨噬细胞肿瘤坏死因子基因转录延长过程中异染色质蛋白1γ和IκB激酶α的相互依赖性

詹姆斯·L·索恩等。 核酸研究. 2012年9月.

摘要

IκB激酶α(IKKα)是细胞质IKK复合体的一部分,调节核因子κB(NF-κB)的释放和转运,以响应促炎信号。IKKα也可以通过NF-κB直接招募到NF-κ的B依赖基因的启动子,在那里它在丝氨酸10磷酸化组蛋白H3,触发含溴蛋白4和正转录延伸因子B的招募,我们报道,在活化的巨噬细胞中,IKKα与核糖核酸聚合酶II的伸长形式以及NF-κB依赖基因的异染色质蛋白1γ(HP1γ)一起旅行。IKKα与HP1γ结合并磷酸化,HP1γ反过来控制IKKβ与染色质的结合以及转录区内丝氨酸31处组蛋白变体H3.3的磷酸化。在转录末端位点的下游,IKKα与其抑制剂CUE结构域蛋白2聚集,表明IKKβ失活与转录终止之间存在联系。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
的响应TNF公司基因座到LPS治疗。(一个)时间进程TNF公司LPS处理对RAW264.7细胞mRNA水平的影响。结果是相对于GAPDH表达表达的。误差条表示三个独立实验的标准偏差(SD)。(B类)用于ChIP实验的TNF基因座内设计的扩增子的位置和名称。用经LPS处理的RAW264.7细胞进行ChIP,持续指定的时间点(分钟):(C类)抗H3K9acS10p(D类)抗IKKα(E类)抗HP1γ(F类)抗H3.3S31p和(G公司)抗HP1γS93p。横轴表示用于实时PCR的引物(与所指示基因附近的转录起始位点或CCCTC结合因子-CTCF结合位点的距离,以kb为单位,见B)。数据与输入进行标准化,然后与背景控制区域的平均值进行标准化。误差条表示来自三个独立qPCR复制的SD。(C–G)数据代表至少三个独立实验。
图2。
图2。
IKKα与HP1γ和组蛋白H3.3相互作用。(一个)用重组HP1γ检测IKKα激酶。用抗IKKα、抗HP1γS93p和抗HP1β进行Western blot。(B类)在存在或不存在重组HP1γ(顶部)或HP1α(底部)的情况下,使用重组IKKα和组蛋白H3.3进行IKK激酶分析。用抗IKKα、抗H3S10p、抗H3.3S31p、抗HP1γ和抗HP1α抗体进行Western blot。(C类)RAW264.7细胞核提取物经LPS处理1次的eCoIP实验h.用于免疫沉淀的抗体在图的顶部命名,用于免疫印迹的抗体在左侧命名。输入为CoIP所用材料的5%。(D类)体外用重组HP1γ–GST或IKKα–GST进行CoIP实验,在有或无ATP的情况下孵育,并用抗HP1γ或抗IKKγ抗体进行免疫沉淀。用抗HP1γ或抗IKKα抗体进行Western blot。(E类)体外用重组HP1α-HIS与重组HP1γ-GST或IKKα-GST孵育,并用抗HP1α或抗IKKγ抗体免疫沉淀,进行CoIP实验。用抗HP1α抗体进行Western blot。
图3。
图3。
IKKα、HP1γ和H3.3S31磷酸化的转录延伸依赖性积累TNF公司轨迹。(一个)RAW264.7细胞与LPS+DRB孵育后,用总细胞提取物通过western blot定量总IKKα、HP1γ、H3.3S31p、H3.3和β-actin蛋白水平。在存在或不存在DRB的情况下用LPS处理RAW264.7细胞30最小LPS(30),30最小LPS+DRB(30+DRB),60最小LPS(60)或30最小LPS,然后是30最小DRB(60+DRB)。ChIP使用(B类)抗IKKα和(C类)抗HP1γ。横轴表示用于实时PCR的引物。数据与输入进行标准化,然后与控制区域的平均值进行标准化。数据代表至少三个独立实验。误差条表示三个独立qPCR复制品的标准偏差(SD)。
图4。
图4。
Re-ChIP。在用LPS处理1次的RAW264.7细胞中执行Re-ChIPh、 抗RNAPII S2p抗体,然后(一个)抗IKKa(B类)抗HP1g和(C类)抗p65抗体。横轴表示用于实时PCR的引物。使用抗RNAPII S2p抗体将数据与IP进行标准化。数据是两个独立实验的代表。误差条表示三个独立qPCR复制品的标准偏差(SD)。
图5。
图5。
IKKα直接与RNAPII CTD S2p结合。(A)用LPS处理的RAW264.7细胞的全细胞提取物执行eCoIP 1h.用于免疫沉淀的抗体在图的顶部命名,用于免疫印迹的抗体在左侧命名。输入为CoIP所用材料的5%。(B类)体外下拉后进行斑点杂交分析。GST-IKKα(2pmol)在不含肽(通道2)或有600个肽的情况下培养pmol CTD-S2p(通道3)或CTD-S5p(通道4)肽或二者的等摩尔混合物(通道5)。将不与RNAPII相互作用的GST对照肽与两种肽的相同等摩尔混合物孵育(泳道1)。使用抗GST珠进行下拉。不受约束和受约束的派系被转移到膜上。用于斑点杂交的抗体在左边命名。(C类)结合IKKα的肽之间的竞争用密度测定法定量。数据表示为比率(绑定/未绑定)S2p + S5p/(绑定/未绑定)S2p或S5p。误差条表示两个独立实验的标准偏差(SD)。(D类)体外使用与CTD S2p对应的生物素化肽进行下拉实验,该肽与重组HP1α、HP1γ和IKKα蛋白在有或无ATP的情况下孵育。
图6。
图6。
HP1γ敲除增加TNF公司并消除H3.3S31磷酸化。(一个)HP1γ,TNF公司使用三种针对HP1γ(sh-1,-2和-3)或萤火虫荧光素酶(sh-c)的shRNAs敲除HP1γ后RAW264.7细胞中IKKαmRNA的水平h LPS处理。结果是相对于GAPDH表达表达的。误差条表示三个独立实验的标准偏差(SD)。(B类)RAW264.7细胞中HP1γ敲除(sh-1)后,用全细胞提取物通过western blot定量HP1γ和β-肌动蛋白总水平。(C类E类)LPS处理RAW264.7细胞1小时后,在HP1γ敲除后进行ChIPh、 带有(C类)抗RNAPII S2p和(E类)抗H3.3S31p抗体。横轴表示用于实时PCR的引物。将数据与输入或(E)总组蛋白H3进行标准化,然后与背景控制区域的平均值进行标准化。(D) MNase处理染色质的qPCR定量。(C–E)数据代表至少三个独立实验。误差条表示来自三个独立qPCR复制的SD。
图7。
图7。
HP1γ敲除降低染色质相关的IKKα。LPS作用1小时后RAW264.7细胞HP1γ基因敲除小时(一个)仅与输入相比,ChIP使用抗RNAPII S2p和抗HP1γ标准化进行。第一个抗RNAPII S2p ChIP的未结合部分用作第二个ChIP的模板(B类)将抗RNAPII S2p和抗HP1γ与未结合部分进行归一化(C类)抗HP1γ和(D类)抗IKKα。(A–D)横轴表示用于实时PCR的引物。(C,D)数据与未绑定分数(Unb)进行标准化,然后与控制区域的平均值进行标准化。数据代表了至少五个独立实验。误差条表示±三个独立qPCR复制品的标准偏差(SD)。
图8。
图8。
CUEDC2在TNF公司基因。(一个)LPS处理RAW264.7细胞核质提取物的eCoIP实验1h,用抗IKKα抗体沉淀,然后用抗HPRT、抗PP1和抗CUEDC2抗体进行western blot。(B类)用抗CUEDC2抗体对LPS处理的RAW264.7细胞进行ChIP。横轴表示用于实时PCR的引物。数据相对于输入进行归一化,然后相对于控制区域的平均值进行归一化。数据是至少三个独立实验的代表。误差条表示±三个独立qPCR复制品的标准偏差(SD)。(C类)转录延长期间IKKα循环活性的建议模型。(步骤1)IKKα和HP1γ均与磷酸化RNAPII CTD结合。IKKα磷酸化HP1γS93。(步骤2)将复合物IKKα/HP1γS93p转移到染色质。(步骤3)HP1γ的存在有利于IKKα磷酸化H3.3S31。(步骤4)RNA聚合酶传代后,H3.3S31磷酸化,未磷酸化的HP1γS93高,IKKα低。(转录终止)CUEDC2与IKKα/HP1γS93p复合物在染色质上共定位,而H3.3S31没有磷酸化。

类似文章

引用人

工具书类

    1. Hayden MS,Ghosh S.NF-kappaB信号传递的共同原则。单元格。2008;132:344–362。-公共医学
    1. Li Y,Reddy MA,Miao F,Shanmugam N,Yee JK,Hawkins D,Ren B,Natarajan R。组蛋白H3赖氨酸4甲基转移酶SET7/9在NF-κB依赖性炎症基因调控中的作用。与糖尿病和炎症的相关性。生物学杂志。化学。2008;283:26771–26781.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Zhong H,Voll RE,Ghosh S.PKA对NF-κB p65的磷酸化通过促进与辅活化因子CBP/p300的新型二价相互作用来刺激转录活性。摩尔细胞。1998;1:661–671.-公共医学
    1. Swaminathan S.IKKalpha:一种染色质修饰剂。自然细胞。生物.2003;5:503.-公共医学
    1. Hargreaves DC,Hong T,Medzhitov R.通过信号依赖性转录延伸控制诱导基因表达。单元格。2009;138:129–145.-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型