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.2012;8(5):e1002691。
doi:10.1371/journal.pgen.1002691。 Epub 2012年5月10日。

组蛋白h1缺失损害胚胎干细胞分化

附属公司

组蛋白h1缺失损害胚胎干细胞分化

张云哲等。 公共科学图书馆-基因. 2012.

摘要

多能干细胞具有相对开放的染色质结构;然而,尽管人们努力研究ESCs的染色质特征,但染色质致密化在干细胞命运和功能中的作用仍不明确。连接蛋白组蛋白H1对高阶染色质折叠很重要,对哺乳动物胚胎发生至关重要。为了研究H1和染色质压实在干细胞多能性和分化中的作用,我们检测了缺乏多种H1亚型的胚胎干细胞的分化。H1c/H1d/H1e三零ESCs在去除白血病抑制因子后,在粘附单层培养中对自发分化更具抵抗力。类似地,大多数三-H1缺失胚状体(EB)缺乏代表三个胚层的形态结构,并保留了未分化胚胎干细胞的基因表达特征。此外,在EB的神经分化过程中,三重H1空细胞培养缺乏突起生长,并且缺乏有效的神经标记物激活。最后,我们发现,与野生型对照组相比,三重H1基因缺失的胚胎和EB不能完全抑制多能性基因的表达,并且H1缺失会损害DNA甲基化和启动子区组蛋白标记的改变,这是在干细胞分化和分化过程中有效沉默多能性基因组Oct4所必需的胚胎发生。总之,我们证明H1在多能性干细胞分化中起着关键作用,我们的结果表明H1和染色质致密化可能通过多能性基因的表观遗传阻遏介导多能性干细胞的分化。

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数字

图1
图1。H1c/H1d/H1e缺失抑制ESC自发分化。
(A) Western blot分析在指定条件下培养2天的WT和H1 TKO ESCs中OCT4水平。(B) WT和H1 TKO ESCs在MEF上培养2天的相图像(左面板),明胶涂层板上培养2天后的相图像。比例尺:100µm。(C) 在含有或不含LIF的明胶涂层板上培养的WT和H1 TKO ESCs的生长曲线。数据表示为平均值±S.D。
图2
图2。H1c/H1d/H1e三敲除ESC在EB分化中受损。
(A) 在旋转悬浮培养的第7天、第10天和第14天,对WT EB(顶部面板)和H1 TKO EB的切片进行苏木精和伊红(H&E)染色。WT EB(右上)和H1 TKO EBs(右下)切片的H&E染色高倍图像显示TKO EBs未能形成空洞。WT EB表现出更多分化形态,形成囊肿(黑色箭头)。(B) 定量RT-PCR分析法新社ESCs(第0天)和EBs在14天的旋转悬浮培养中。数据在表达水平上进行了标准化GAPDH公司和表示为WT和H1 TKO ESCs形成的ESCs(第0天)和EBs(第10天)的qRT-PCR SuperArray基因表达谱的平均±S.D.(C)层次聚类分析。红色、绿色或黑色表示相对表达较高、较低或无变化。(D) 基因表达比较的散点图分析:(i)WT与。H1 TKO ESCs(第0天);(ii)WT EB(第10天)与。WT ESCs(第0天);(iii)H1 TKO EB(第10天)与。H1 TKO ESCs(第0天)。X轴和y轴是增量CT,使用GAPDH公司正常化。具有2倍以上差异的基因位于蓝线之外。
图3
图3。H1 TKO ESCs不能进行神经分化。
(A) ESCs的神经分化方案。(B) 神经分化方案下第6+7天WT和H1 TKO培养物的特征。i) ●●●●。相位对比图像显示H1-TKO突变体无法充分形成神经突起和神经网络。右面板:放大用黑色矩形包围的区域的图像。比例尺:100微米(左侧面板)和50微米(右侧面板)。ii)。左侧面板:神经形成EB的百分比。数字是6个实验的平均值。每个实验计数80个EB。右侧面板:每个神经突形成EB的神经突数量。从产生轴突的EB中计算轴突的数量。分别从WT和TKO中选择58和28个形成神经突的EB,并计算其神经突数量。**:P<0.01;****:P<0.0001。iii)。TUBB3和GFAP表达的免疫染色。细胞核用Hoechst 33342染色。比例尺:50微米(左侧面板)和20微米(右侧面板)。结果代表了三个独立的实验。(C) H1 TKO ESCs不能充分抑制多能性基因并有效诱导神经基因的表达。多能性基因的表达水平(10月4日纳克),神经标记(内斯汀),神经元标记(酪氨酸羟化酶(TH)),星形胶质细胞标记物(GFAP公司)用qRT-PCR检测WT和H1 TKO培养物在分化培养中的指定天数。数据在表达水平上进行了标准化GAPDH公司并表示为平均值±S.D。
图4
图4。EB分化期间WT和H1 TKO培养物中连接蛋白组蛋白的表达谱。
(A) WT和H1 TKO ESCs组蛋白的反相HPLC和质谱(插入)分析。X轴:洗脱时间;Y轴:A处的吸光度214.mAU,毫吸收单位。插图显示了从WT组蛋白的HPLC洗脱液中收集的H1d/H1e组分中H1d和H1e质谱峰的相对信号强度。EB形成和分化期间总H1(B)和单个H1亚型(C)的(B,C)H1/核小体比率。收集第0天、第7天和第10天的EB培养物,并进行HPLC分析,如(A)所示。总H1(或单个H1亚型)与核小体的比率如材料和方法中所述进行计算。数值为平均值±S.D.,n = 4.*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001;****:P<0.0001。
图5
图5。H1是稳定抑制10月4日胚胎发生和ESC分化过程中的多能性基因。
(A) 高架10月4日CpG位点的表达和低甲基化10月4日H1 TKO胚胎中的启动子与E8.5的同窝卵比较。(i) mRNA表达水平的qRT-PCR分析10月4日值为平均值±SEM,n = 每个基因型5个。表达水平标准化超过GAPDH公司.*:P<0.05。(ii)DNA甲基化状态的亚硫酸氢盐测序分析10月4日启动子区域。显示了两个野生型和两个E8.5基因敲除胚胎的结果。所分析的CpG位点的位置被示意性地描述为线上的垂直勾号。TSS:转录起始位点。(iii)甲基化CpG位点的百分比10月4日WT和H1 TKO胚胎的启动子区。使用Fisher精确检验进行统计分析。***:P<0.001;****:P<0.0001。(B) 表达和表观遗传标记分析10月4日旋转悬浮培养EB分化过程中的多能性基因。表达分析(i),DNA甲基化(ii),mCpG的百分比(iii);H1和三个组蛋白标记(iv)的占据10月4日EB分化过程中WT、H1 TKO和RES细胞。相对表达水平标准化为GAPDH公司。通过将ESC(第0天)或EB在每个时间点的qChIP值(如材料和方法中所述)与WT ESC(WT D0)的值标准化,计算相对褶皱富集度。数值表示为平均值±S.D.*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001。(C) 抑制H1的模型10月4日ESC分化期间。ESCs的H1含量较低,染色质相对“开放”。在分化过程中,总H1含量增加,这有助于在10月4日基因,并有助于建立和/或维持稳定沉默所需的表观遗传学变化10月4日多能性基因。

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