Mediation of the antiapoptotic activity of Bcl-xL protein upon interaction with VDAC1 protein

doi:10.1074/jbc.M112.345918

.2012年6月29日；287(27):23152-61.

doi:10.1074/jbc。M112.345918。 Epub 2012年5月15日。

Bcl-xL蛋白与VDAC1蛋白相互作用后抗凋亡活性的调节

尼尔·阿贝尔¹, 丹亚·本·哈伊, 瓦尔达·肖珊·巴马茨

附属公司

PMID： 22589539
预防性维修识别码：项目经理3391160
内政部： 10.1074/jbc。M112.345918号

Bcl-xL蛋白与VDAC1蛋白相互作用后抗凋亡活性的调节

尼尔·阿贝尔等。生物化学杂志. 2012.

.2012年6月29日；287(27):23152-61.

doi:10.1074/jbc。M112.345918。 Epub 2012年5月15日。

作者

尼尔·阿贝尔¹, 丹亚·本·哈伊, 瓦尔达·肖珊·巴马茨

附属

¹内盖夫生命科学系和国家生物技术研究所，内盖夫Ben-Gurion大学，Beer-Sheva 84105，以色列。

PMID： 22589539
预防性维修识别码：项目经理3391160
内政部： 10.1074/jbc。M112.345918号

摘要

线粒体蛋白，即电压依赖性阴离子通道（VDAC），与细胞凋亡的控制有关，包括通过其与促凋亡和抗凋亡蛋白的相互作用。我们之前证明了Bcl2与VDAC的直接相互作用，导致通道电导降低。基于VDAC1的肽与Bcl2相互作用以阻止其抗凋亡活性。在这里，我们使用多种方法展示了抗凋亡蛋白Bcl-xL与VDAC1的相互作用，并揭示了这种相互作用介导Bcl-xL对凋亡的保护。C末端截断的Bcl-xL（Δ21）与纯化的VDAC1相互作用，如微尺度热泳法所示，并反映在双层重组VDAC1的通道电导率降低中。Bcl-xL的过度表达可阻止staurosporine诱导表达天然VDAC1但不表达特定VDAC1突变体的细胞凋亡。在鉴定了VDAC1中干扰Bcl-xL相互作用的突变后，设计并产生了代表VDAC1序列的某些肽，包括N末端结构域，作为重组和合成肽。表面等离子体共振显示，VDAC1 N末端区域和两个内部序列以浓度和时间依赖性的方式与固定化Bcl-xL（Δ21）特异结合。此外，在过度表达Bcl-xL的细胞中表达重组肽可阻止该蛋白对staurosporine诱导的凋亡提供保护。这些结果表明Bcl-xL作为抗凋亡蛋白发挥作用，通过与VDAC1结合促进肿瘤细胞存活。这些发现表明，VDAC1基肽干扰Bcl-xL与线粒体的结合可能有助于诱导癌细胞凋亡，并增强常规化疗药物的疗效。

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数字

**图1。**
**Bcl-xL（ΔC21）降低双层VDAC电导。** A类，VDAC被重组为PLB，在添加纯化的Bcl-xL（ΔC21）（10 n米). 电流记录后顺式隔间灌注缓冲液以将Bcl-xL（ΔC21）浓度降低几倍。这个虚线指示零电流水平。B类，显示了作为电压函数的多通道记录（每种电压下4s），以及之前mVDAC1的平均稳态电导(●) 30分钟后(○) 添加Bcl-xL（ΔC21）（10 n米)将溶液与无Bcl-xL（ΔC21）介质交换后(△). 相对电导被确定为给定电压下的电导比(*G公司*)达到最大电导(去吧).C类显示了考马斯亮蓝纯化的VDAC和Bcl-xL（Δ21）蛋白。

**图2。**
**VDAC与荧光标记的Bcl-xL（Δ21）和Bcl2（Δ23）的结合。** A类和B类，Bcl-xL（Δ21）(A类)和Bcl2（Δ23）(B类)使用NanoTemper蛋白标记试剂盒RED进行荧光标记。该分析在含有0.005%吐温20的PBS缓冲液中进行。VDAC的浓度变化范围为2.4 n米至20μ米而标记的Bcl-xL的浓度在20 n时保持不变米。培养20分钟后，将3-5μl样品加载到MST级玻璃毛细管中，并使用Monolith-NT115仪器测量热泳现象。Δ*F表单*%，归一化荧光的变化百分比。

**图3。**
**在天然VDAC1或E65Q-而不是E72Q-或E202Q-VDAC1突变体上观察到Bcl-xL降低通道电导和保护细胞凋亡。** A类将野生型E65Q-、E72Q-或E202Q-VDAC1重组为PLB，在添加纯化Bcl-xL（ΔC21）（10 n米).B类，分别用编码Bcl-xL的质粒pEGFP-Bcl-xL或编码天然E65Q-、E72Q-或E202Q-VDAC1的pcDNA4/TO（或质粒pcDNA4/TO，作为对照）瞬时共转染T-REx-293细胞，并在暴露于STS（1.25μ米)用吖啶橙/溴化乙锭染色定量分析细胞凋亡。数据表示平均值±S.E(n个= 3).

**图4。**
**在T-REx-293细胞中表达基于VDAC1的肽可防止Bcl-xL介导的对STS诱导的细胞死亡的保护。** A类和B类，T-REx-293细胞被转染以表达Bcl-xL和/或根据最初提出的拓扑模型（17）设计的基于VDAC1的肽（N末端(*N-第三方*); LP1；LP2；LP3；和LP4）(A类)或新提出的拓扑模型（-15）（L4–5、L14–15、L16–17和L18–19）(B类). 用四环素（1.5μg/ml）诱导基于VDAC1的肽表达。用STS（1.25μ米吖啶橙/溴化乙锭染色定量分析。数据表示平均值±S.E(n个= 3).

**图5。**
**选定的基于VDAC1的肽与Bcl-xL（ΔC21）以特定和剂量依赖的方式相互作用。**使用实时SPR揭示了纯化的Bcl-xL（ΔC21）与基于VDAC1的合成肽的相互作用。将固定在GLM传感器表面的Bcl-xL（△C21）暴露于基于VDAC1-的肽：A类，N终点(*N-第三方*)（50、100和200μ米);B类、LP4（50、100和200μ米);C类、LP1（50、100和200μ米);D类、LP2（50、100和200μ米). 肽在含有固定化Bcl-xL（ΔC21）和响应（共振单元，*俄罗斯*)使用ProteOn成像系统和相关软件工具监测肽浓度。所有实验均在25°C下进行。这个固体和*虚线箭头*分别表示含肽和无肽样品的运行情况。

**图6。**
**VDAC1的N-末端结构域是其与Bcl-xL（ΔC21）相互作用所必需的。**VDAC1和Δ（26）VDAC1在无孔酵母线粒体中表达，纯化并重组为PLB。A类Bcl-xL降低了VDAC1的电导，但对N末端截断的VDAC1通道活性没有影响。在添加Bcl-xL之前和10分钟之后，记录了通过双层重新构成的VDAC1或Δ（26）VDAC1的电流，以响应0到−10 mV的电压阶跃。这个虚线指示零和最大电流水平。B类，记录了响应从0 mV到−60和+60 mV之间的电压阶跃通过VDAC1通道的电流。相对电导被确定为给定电压下的电导比(*G公司*)达到最大电导(去吧). 使用VDAC1显示了四个类似实验的代表(●) 和Δ（26）VDAC1(○) 向Δ（26）VDAC1中添加Bcl-xL（Δ21）后30分钟(△).

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