Endolysosome involvement in LDL cholesterol-induced Alzheimer's disease-like pathology in primary cultured neurons

doi:10.1016/j.lfs.2012.04.039

.2012年12月10日；91(23-24):1159-68.

doi:10.1016/j.lfs.2012.04.039。 Epub 2012年5月11日。

原代培养神经元内溶酶体参与低密度脂蛋白胆固醇诱导的阿尔茨海默病样病理

梁辉¹, 陈雪松, 乔纳森·盖革

附属机构

采购管理信息： 22580286
PMCID公司：项目经理3431446
内政部： 2016年10月10日/j.lfs.2012.04.039

原代培养神经元内溶酶体参与低密度脂蛋白胆固醇诱导的阿尔茨海默病样病理

梁辉等。生命科学. 2012.

.2012年12月10日；91(23-24):1159-68.

doi:10.1016/j.lfs.2012.04.039。 Epub 2012年5月11日。

作者

梁辉¹, 陈雪松, 乔纳森·盖革

附属

¹美国南达科他州大福克斯北达科他大学医学与健康科学学院药理学、生理学和治疗学系，邮编58203。

采购管理信息： 22580286
PMCID公司：项目经理3431446
内政部： 2016年10月10日/j.lfs.2012.04.039

摘要

目的：循环胆固醇水平升高是导致散发性阿尔茨海默病（AD）发病的外在因素。我们之前的研究表明，喂食富含胆固醇的食物的兔子表现出血脑屏障（BBB）功能障碍，脑神经元中载脂蛋白B（ApoB）的积累增加，脑内溶酶体的结构和功能受到干扰。这些影响与淀粉样β（Aβ）生成增加、τ蛋白表达增加和突触完整性受损有关。由于内溶酶体的病理变化是散发性AD的早期事件，因此我们在此确定了含载脂蛋白B的低密度脂蛋白胆固醇改变内溶酶体结构和功能的程度，以及在原代培养神经元中促进AD-like病理学的发展。

主要方法：从组织学角度测定胆固醇分布和内溶酶体形态。用LysoSensor染料按比例测量内溶酶体pH值。测定酸性磷酸酶、组织蛋白酶B和D以及β位点APP裂解酶1（BACE-1）的内溶酶体酶活性。使用ELISA、免疫印迹和免疫染色技术检测AD样病变，包括Aβ生成增加、τ蛋白表达增加和突触完整性受损。

主要发现：用含有载脂蛋白B的低密度脂蛋白胆固醇处理神经元，增加了胆固醇的内溶酶积累，内溶酶增大，内溶酶体pH升高。此外，含有载脂基因B的低浓度脂蛋白胆固醇增加了BACE-1的内溶酶体聚积，增强了BACE-1-活性，增加了Aβ水平，增加了磷酸化tau水平，突触素水平降低。

意义：我们的研究结果强烈表明，内溶体结构和功能的改变在显示AD的病理特征中起着关键作用，AD是由神经元暴露于含有ApoB的LDL胆固醇所致。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明，不存在利益冲突。

数字

图1
低密度脂蛋白胆固醇增加了神经元中胆固醇的积累。（A）用低密度脂蛋白胆固醇（50µg/ml）处理3天的神经元表现出游离胆固醇分布的改变（filipin染色）；胆固醇分布在对照神经元的质膜附近和低密度脂蛋白胆固醇处理神经元的胞浆中。棒材=10µm。（B） Dil标记的LDL（红色）与内溶酶体（绿色，lysoTracker）共同分布。棒材=10µm。

图2
低密度脂蛋白胆固醇改变了内溶酶体的结构。（A） LDL处理（50µg/ml）3天增加了原代培养皮层神经元内溶酶体（lysoTracker）的大小。棒材=10µm。（B）低密度脂蛋白胆固醇处理3天，显著改变了内体（EEA1）和溶酶体（LAMP1）的结构；在对照神经元中，内切体和溶酶体的大小相对较小、均匀且分布均匀，而在低密度脂蛋白胆固醇处理的神经元中，它们明显增大并聚集在一起。（C）低密度脂蛋白胆固醇（50µg/ml）治疗3天后，EEA1和LAMP1的蛋白质水平显著升高。GAPDH用作负荷控制（n=4；**p<0.01）。

图3
低密度脂蛋白胆固醇扰乱了内溶酶体的功能。（A）用LysoSensor染料按比例测量内溶酶体pH值。低密度脂蛋白胆固醇治疗（50µg/ml）3天后，神经元内溶酶体pH值显著升高（n=8；***p<0.001）。（B）低密度脂蛋白胆固醇治疗（50µg/ml）3天后，酸性磷酸酶、组织蛋白酶B和组织蛋白酶D的蛋白质水平增加（n=4；**p<0.01；**p<0.001）。GAPDH被用作负荷控制。与对照组相比，（C、D、E）低密度脂蛋白胆固醇治疗（50µg/ml）降低组织蛋白酶B、组织蛋白酶D和酸性磷酸酶的特定酶活性（n=6；*p<0.05；***p<0.001）。

图4
低密度脂蛋白胆固醇增加了Aβ的生成。（A）低密度脂蛋白胆固醇治疗（50µg/ml）3天后，Aβ水平显著升高_1–40和Aβ_1–42与对照组相比（n=8；**p<0.01；**p<0.001）。（B）低密度脂蛋白胆固醇治疗（50µg/ml）3天增加了Aβ（4G8）与内体（EEA1）和溶酶体（LAMP1）的共分布。棒材=10µm。（C）低密度脂蛋白胆固醇治疗（50µg/ml）3天增加了APP（N-末端APP）与内体（EEA1）和溶酶体（LAMP1）的共分布。棒材=10µm

图5
低密度脂蛋白胆固醇增加BACE-1活性。（A）低密度脂蛋白胆固醇治疗未显著改变BACE-1的mRNA水平（n=8）。（B）低密度脂蛋白胆固醇治疗未显著改变BACE1蛋白水平（n=6）。（C）低密度脂蛋白胆固醇治疗显著增加BACE1特异性酶活性（n=8；*p<0.05）。（D）低密度脂蛋白胆固醇处理增加了BACE1与内体（EEA1）的共分布。棒材=10µm。（E）低密度脂蛋白胆固醇处理增加了BACE1与溶酶体（LAMP1）的共分布。棒材=10µm。

图6
低密度脂蛋白胆固醇改变磷酸化tau的表达和分布。（A）低密度脂蛋白胆固醇治疗（50µg/ml）3天显著增加了用tau-5抗体检测的磷酸化tau（AT8）与总tau的比率（n=6，***p<0.05）。（B）低密度脂蛋白胆固醇处理（50µg/ml）3天增加了磷酸化τ（AT8）与内体（EEA1）的共分布。棒材=10µm。（C）低密度脂蛋白胆固醇治疗（50µg/ml）3天增加了磷酸化τ（AT8）与溶酶体（LAMP1）的共分布。棒材=10µm。

图7
低密度脂蛋白胆固醇改变突触素的表达和分布。（A）低密度脂蛋白胆固醇治疗（50µg/ml）3天后，突触素的蛋白质水平降低（n=6；**p<0.01）。（B）低密度脂蛋白胆固醇治疗（50µg/ml）3天增加了突触素与内体（EEA1）的共分布。棒材=10µm。（C）低密度脂蛋白胆固醇治疗（50µg/ml）3天增加了突触素与溶酶体（LAMP1）的共分布。棒材=10µm。

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