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.2012;7（5）：e36616。
doi:10.1371/journal.pone.0036616。 Epub 2012年5月4日。

质子辅助氨基酸转运蛋白PAT1与Rag GTP酶复合并激活晚期内涵体和溶酶体膜上的TORC1

玛格丽特·霍格蒙德斯多蒂尔 1, 萨宾·海布林, 舒巴纳·卡齐, 布鲁诺·雷诺兹, Shivanthy M Visvalingam公司, 迈克尔·K·肖, 黛博拉·C·I·戈伯丹
附属公司

质子辅助氨基酸转运蛋白PAT1与Rag GTPases复合并激活晚期内体和溶酶体膜上的TORC1

玛格丽特·霍格蒙德斯多蒂尔等。 公共科学图书馆一号. 2012.

摘要

雷帕霉素复合物1（mTORC1）的哺乳动物靶点被生长因子调节的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt/Rheb信号和细胞外氨基酸（AA）激活，以促进生长和增殖。这些AA诱导mTOR向晚期内胚体和溶酶体（LEL）移位，随后通过涉及腔内AA存在的机制激活，以及mTORC1与包含Rag GTPases和异三聚体Ragulator复合体的多蛋白组装体之间的相互作用。然而，AAs控制mTORC1激活的这些不同方面的机制尚不清楚。我们最近发现，细胞内质子辅助氨基酸转运蛋白1（PAT1）/SLC36A1是AA-依赖性mTORC1激活的重要介质。在这里，我们在人类胚胎肾（HEK-293）细胞中证明，PAT1主要位于LEL上，与Rag GTPases发生物理相互作用，并且是正常AA-依赖性mTOR重定标所必需的。我们还使用果蝇体内强大的遗传方法来研究PAT1/Rag/Raulator复合物的调节。我们发现，GFP标记的PAT位于体内细胞表面和LEL，反映了PAT1在几种正常哺乳动物细胞类型中的分布。升高的PI3K/Akt/Rheb信号增加PAT的细胞内水平，并通过需要内吞的机制协同增强PAT诱导的生长。鉴于最近发现液泡H（+）-ATPase是另一种Rag相互作用组分，我们提出了一种模型，其中PAT作为AA-感应引擎的一部分发挥作用，该引擎从LEL腔室驱动mTORC1激活。

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数字

图1
图1。AA刺激后，mTOR定位于LAMP2/PAT1-阳性的隔室。
(A类,B类)在稳定转染的HEK-293细胞系中过度表达的Flag-PAT1（红色；B）具有与内源性PAT1（绿色；a）相似的细胞内定位模式。显示了稳态条件下的电池。(C类)内源性PAT1与LAMP2强烈共定位，标志着LEL亚区。AA饥饿50分钟后，再刺激10分钟，对细胞进行染色。合并显示LAMP2（红色）、PAT1（绿色）和DAPI（蓝色）。(D类,E类)AA饥饿50分钟（D）和50分钟AA饥饿后再刺激10分钟（E），LAMP2、Flag-PAT1和mTOR的亚细胞定位。请注意，Flag-PAT1和LAMP2在这两种情况下都是共定位的，但在AA刺激后，mTOR仅被招募到有限数量的LEL。Merge显示Flag-PAT1（红色）、mTOR（绿色）和DAPI（蓝色）。B和E中的比例尺为10µm，A；B中的标尺也适用于A和C，E中的标杆也适用于D。
图2
图2。Flag-PAT1和mTOR共同定位于同一细胞隔室的表面。
(A类)稳定的HEK-293细胞系超薄切片过度表达Flag-PAT1并用抗Flag抗体（5 nm金）标记或(B–D类)联合标记抗Flag（5纳米金）和抗mTOR（10纳米金）抗体。内源性mTOR和Flag-PAT1存在于通常包含电子致密核的相同膜结合隔室的表面。箭头标记了免疫标记mTOR与Flag-PAT1足够接近的位置子集，从而成为多分子复合物的一部分。所有面板中的比例尺均为200 nm。
图3
图3。PAT1与Rag GTPases共定位并能进行物理交互。
(A类,B类)在稳定的过度表达Flag-PAT1的HEK-293细胞系中，在AA-sarved（a）和AA-simmulated（B）条件下，Flag-PAT 1与含有内源性RagC的细胞隔亚群共定位。(C类)在稳态条件下，Flag-PAT1的免疫沉淀导致内源性RagC的共同免疫沉淀，而不是微管蛋白。(D类)相反，在HEK-293细胞中瞬时表达的Flag-RagD而非Flag-Rap2A的免疫沉淀导致内源性PAT1而非微管蛋白的共同免疫沉淀，这表明Rag GTPases与细胞中的PAT1复合。A中的比例尺为10µm，适用于A和B中的所有面板。
图4
图4。PAT1将mTOR的AA-依赖重定标调节为LEL。
(A类,B类)与用扰乱的siRNA（scr；a）处理的细胞相比，HEK-293细胞中PAT1（PAT1kd）的敲除减少了AA刺激的mTOR（绿色）到LAMP2阳性（红色）LEL的积累（B）。(C类,D类)重要的是，PAT1型敲低并不能从细胞中消除所有的PAT1蛋白（与C中的对照细胞相比，D），因此B中残留的mTOR重定位可能是由低水平的PAT1的存在引起的。PAT1抗体染色显示为绿色，LAMP2显示为红色。A中的比例尺为10µm，适用于所有面板。
图5
图5。果蝇属PAT-GFP融合蛋白具有与未标记PAT相似的功能活性体内.
由GS插入物合成的无标记转运体路径(路径GS13857标准；B、 H、N）和CG1139型(CG1139型GS10666标准；C、 I，O）和标记转运蛋白合成自UAS-通道-GFP（D、J、P）和UAS-CG1139-GFP第1行（E，K，Q）和第2行（F，L，R）插入物在含有或不含其他转基因的GMR-GAL4的苍蝇眼分化细胞中表达。(A类–F类)的过度表达路径GS13857标准（B） 和CG1139型GS10666标准（C） 与对照组相比，小腹大小显著增加（a）。PATH-GFP（D）和CG1139-GFP品系1（E）的生长增加更为轻微，但也更为显著。CG1139品系2产生一种肿胀且无组织的眼睛表型（F）。对于尺寸比较，n = 6; 面板底部A–E，相对于对照的平均值±标准差；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。(G公司–L（左）)过度表达导致的过度生长UAS-Rheb公司与GMR-GAL4（G）协同作用，通过标记和未标记转运体（H–L）的共同表达增强，表明Rheb信号在控制PAT的生长-增殖活性中起作用。(M（M）–R（右）)过度表达狐狸GS9928标准与GMR-GAL4相比，标记和未标记转运体（N–R）的共同表达增强了GMR-GAL 4，这在眼睛的腹后缘最为明显（M中的箭头），与这些分子通过TORC1信号级联作用抑制Akt并增强FOXO活性一致。比例尺为100µm，适用于所有面板。当转基因表达不干扰小体阵列时，进行小体尺寸测量。
图6
图6。果蝇属PAT位于细胞表面和LEL隔间体内.
(A类,B类)PATH-GFP（绿色）在生活中的表达果蝇属S2细胞用酸性染料Lysotracker Red染色。一些PATH-GFP出现在质膜上（白色箭头），但大多数位于细胞内隔间的表面。它通常不与染色最强烈的Lysotracker Red阳性区室（可能是溶酶体，例如红色箭头）共定位，但与染色不太强烈的Lysotracker Red阳性区室（可能是晚期内体和一些溶酶体，例如黄色箭头）共定位，可能是因为GFP荧光或完整性在高酸性条件下受到影响。此外，一些含有PATH-GFP的隔间不会与Lysotracker Red（例如绿色箭头）共存。(C类,D类)在Lsp2-GAL4控制下，幼虫脂肪体中表达的PATH-GFP（绿色）也仅与活组织中Lysotracker Red阳性亚群共定位（例如，用箭头标记的示例，如a和B），但也在细胞表面高水平表达。注意，在D中，PATH-GFP在一些较大的Lysotracker红阳性结构（黄色箭头）和其他膜结构（绿色箭头）的表面特异表达，与其已知的膜结合一致。(E类)CG1139-GFP与HRP-Lamp1（一种晚期内体和溶酶体标记物）染色的许多但不是所有隔室在固定的幼虫脂肪体（例如黄色箭头）中共存，表明部分但不是全部细胞内CG1139位于LEL中。细胞核在E〃用DAPI（蓝色）染色。A、B和D中的标尺为5µm，C和E中的标杆为20µm。
图7
图7。PAT转运体的促生长活性通过PI3K/Akt信号的过度激活而协同增强。
(A类–C类)GAL4-UAS诱导苍蝇PAT转运体基因过度表达，路径（B） 和CG1139型（C） 与正常动物相比，GMR-GAL4促进分化眼的生长增加（A）。(D类–F类)当在PTEN公司突变背景（D）路径（E） 和CG1139型（F） on-growth是协同增强的，导致高度过度生长，眼睛凸出表型。给出了眼睛的全向尺寸测量值，其中全向阵列是规则排列的（n = 6; 面板底部A–C，相对于控制（A）的平均值±标准差*P<0.001，与对照组相比增加）。苍蝇基因型是w个;GMR-GAL4公司（A） ，w个;GMR-GAL4公司/路径GS13857标准（B） ，w个;GMR-GAL4公司/CG1139型GS10666标准（C） ，声母;PTEN公司1FRT40A型/P[周+]l（2）3.1 FRT 40A;GMR-GAL4型（D） ，声母;PTEN公司1FRT40A型/P（w）+]l（2）3.1 FRT 40A;GMR-GAL4公司/路径GS13857标准（E） 和声母;PTEN公司1FRT40A型/P[周+]l（2）3.1 FRT 40A;GMR-GAL4公司/CG1139型GS10666标准（F） ●●●●。
图8
图8。PI3K/Akt/Rheb信号促进PAT穿梭至内胚体室。
(A、 C类)使用Lsp2-GAL4在幼虫脂肪体中表达的CG1139-GFP定位于质膜（白色箭头）和细胞质中的细胞内LEL（黄色箭头；A）。与细胞表面CG1139-GFP（C）相比，Rheb的过度表达导致细胞内（包括核周）蛋白质的相对比例增加。(B类,D类)当CG1139-GFP与Shibire的显性阴性版本共同表达时K44A公司在Rheb存在（D）或不存在（B）时，转运蛋白主要位于质膜上（白色箭头），这强烈表明PAT通常从细胞表面穿梭到LEL。(E类,F类)测量a-D基因型（灰色条；误差条 = 标准差（单位：F）。每个基因型的平均细胞大小也以F表示（蓝色条；误差条 = s.d.）。n个 = 25; *P<0.001（增加）和■与非Rheb/non-Shi相比，P<0.001（下降）K44A公司-表达控制；■ ■P<0.001，与Rheb过度表达对照组相比下降。Rheb诱导的细胞内PAT的变化和PAT诱导的生长完全依赖于内吞作用。(G公司,H（H）)在幼虫眼视盘中，在GMR-GAL4对照（G）下表达的CG1139-GFP主要位于质膜处或质膜附近，例如位于围绕每个小眼的扁平非感光细胞的表面（白色箭头）。Rheb（H）的共表达导致小眼大得多，小眼边界周围的染色减少（白色箭头），CG1139-GFP细胞质表达增加，包括强烈的细胞内染色点（黄色箭头），这与Rheb促进PAT在该组织内吞作用一致。G和H中单个小叶的轮廓用虚线标记。A中的比例尺为20µm，适用于面板A–D，G中的比例尺为5µm，适用于面板G和H。
图9
图9。通过PAT1/Rag/Ragulator/v-ATP酶营养复合物对晚期内体和溶酶体中mTORC1的AA-依赖性调节。
我们已经表明，定位于晚期内体和溶酶体（LEL）的质子辅助氨基酸转运蛋白（PAT）与Rag GTP酶（Rags）相互作用，是mTORC1激活所必需的。Ragulator是一组三聚体蛋白质，参与将复合物附着到脂质双层。最近的研究还表明，液泡H+-ATP酶（v-ATP酶）与激活的Rag（Rag*）/Ragulator复合物相互作用，以控制氨基酸（AA）依赖的mTORC1激活，这由LEL中细胞外AA的快速积累调节。这表明了一个模型，在该模型中，作为对AAs的响应（比较上部LEL和下部AA-模拟LEL），这些不同的分子形成了一个我们称之为“营养素”的复合物。质子通过这个营养引擎的循环引起构象变化，激活mTORC1，导致翻译和细胞生长增加。重要的是，来自胰岛素受体（InR）的信号和PI3K/Akt/Rheb级联的随后激活促进PAT从细胞表面穿梭到LEL膜，从而增加PAT依赖性mTORC1的激活和细胞生长。此外，AAs在LEL腔中的积累可能涉及通过目前未知的氨基酸转运蛋白（AAT）或潜在的内吞作用转运到细胞内的内粒体隔室（如左侧隔室所示）。细胞质亮氨酸（Leu）可通过异二聚体AAT CD98进入细胞，已被证明在激活某些培养细胞中的mTORC1中起关键作用，并可能在这一过程中发挥关键作用。Leu或其他AA流入内溶酶体系统可能最终允许PAT1的AA底物通过AA交换机制积聚在LEL中，导致PAT1介导的营养素活化。导致下游组分活化或抑制的相互作用分别用实心箭头和实心条表示，特定分子的运动用虚线箭头表示，涉及膜穿梭的过程用虚线箭表示。
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