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.2012;7(5):e35890。
doi:10.1371/journal.pone.0035890。 Epub 2012年5月2日。

改变肝脏蛋白酶体组件的组成有助于增强长寿命裸鼹鼠的蛋白酶体活性

附属公司

改变肝脏蛋白酶体组件的组成有助于增强长寿命裸鼹鼠的蛋白酶体活性

卡尔·A·罗德里格斯等。 公共科学图书馆一号. 2012.

摘要

寿命最长的啮齿动物,裸鼹鼠(Bathyergidae;Heterochealus glaber),在其32年的寿命中,至少75%的时间里保持着健康的状态,这表明在这个寿命特别长的物种中,常规观察到的基因组完整性或蛋白质稳态的下降要么减弱,要么延迟。泛素-蛋白酶体系统(UPS)通过降解氧化损伤和错误折叠的蛋白质,在蛋白质稳态中发挥着不可或缺的作用。在这项研究中,我们检测了裸鼠和小鼠在全肝裂解物以及三种亚细胞组分中的蛋白酶体活性,以探讨UPS显著增强功效的机制。我们发现,与小鼠样品相比,裸鼹鼠的类糜蛋白酶(ChT-L)活性显著提高,类胰蛋白酶(T-L)在整个裂解物和细胞溶质组分中增加了两倍。全组织裂解物的天然凝胶电泳表明,20S蛋白酶体在长寿物种中更为活跃,26S蛋白酶体更为活跃且数量更多。Western blot分析显示,裸鼹鼠体内19S亚基和免疫蛋白酶体催化亚基的含量都较高,这表明观察到的更高的比活性可能是由于健康年轻人肝脏中免疫蛋白酶体的比例较高。因此,该物种中的蛋白酶体似乎已准备好有效去除应激损伤的蛋白质。对裸鼹鼠蛋白酶体及其调控的进一步描述,将有助于我们深入了解这些动物的细胞如何应对不断增加的压力和蛋白质损伤,以维持其组织的长期健康,最终延长寿命。

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竞争利益:提交人声明,不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。裸鼹鼠的全细胞裂解液中的糜蛋白酶和类胰蛋白酶活性(而非类半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性)高于小鼠裂解液。
在每次分析中,使用50µg生理年龄匹配的幼鼠(4个月)和裸鼹鼠(2年)的全细胞肝裂解物。样品与100µM特定于被测蛋白酶体活性中心类型的底物孵育。将通过滴定法测定的蛋白酶体抑制剂N-(苄基氧羰基)亮氨酸-亮氨酸(MG132)的饱和浓度添加到平行样品中。用有抑制剂和无抑制剂时释放的荧光的差异来衡量蛋白酶体的特异性肽溶解活性。阴影线表示非特异性蛋白酶活性超过净特异性蛋白酶体活性的量。数值为平均值±SE。图中显示了有效的p值。
图2
图2。与小鼠相比,裸鼹鼠的蛋白酶体活性更高,这是由于26S蛋白酶体的比活性增加所致。
(A) 凝胶内蛋白水解分析的酶谱显示,与小鼠相比,裸鼹鼠提取物表现出更高的26S和20S活性。(B) 将同一天然凝胶转移到PVDF膜上进行免疫印迹,并用α7蛋白酶体亚基特异性抗体进行检测,结果表明裸鼹鼠比小鼠含有更多的26S蛋白酶体,但两种动物的20S蛋白酶体水平相似。(C) 天然凝胶酶谱和蛋白质印迹的定量。面板A和B都代表了对12个样品进行定量的几个实验。酶谱显示裸鼹鼠的26S蛋白酶体活性约为小鼠的3倍,20S蛋白酶体亚组分的活性为小鼠的5倍。26S带和20S带中α7亚基的含量在两个物种中相似。我们还注意到,在这两个物种中,20S带中的α7亚基含量远高于26S带。然而,该条带中检测到的低活性表明,26S络合物的比活性比20S络合物高10倍以上,裸鼹鼠的比活性是26S和20S活性的3-5倍。所示直方图值为平均值±SE。图中显示了重要的p值。
图3
图3。天然凝胶电泳也显示出较高水平的关键19S亚基。
我们定量了用19S ATP酶RPT5抗体探测的肝组织裂解物免疫印迹中的蛋白质水平。分析显示,裸鼹鼠的蛋白质水平比小鼠高三倍(p<0.001)。使用了每种物种三个不同个体的样本。
图4
图4。蛋白酶体亚基组成分析表明,裸鼹鼠19S和免疫蛋白酶体亚单位的蛋白质含量高于小鼠。
(A) 用20S、26S和免疫蛋白酶体亚单位特异性抗体对PVDF转移蛋白的代表性Western blot进行检测。不同亚基的不同含量揭示了特定蛋白酶体亚组的上调。每次实验使用来自每个物种的三只不同动物的样品,并用来自不同动物的样本重复实验至少一次,以验证结果。这些斑点是这些集合的代表。肌动蛋白被用作我们分析的负荷控制。对于免疫蛋白酶体亚单位,还使用小鼠脾组织(MsSp)的裂解物作为阳性对照。(B) 按20S、19S或免疫蛋白酶体分组的蛋白质印迹定量。与小鼠相比,裸鼠不仅具有更高的组成性非催化亚单位含量,而且还具有更多的免疫蛋白酶体成分(β2i、β5i、PA28α)。裸鼹鼠的两个关键19S亚基(RPT5,RPN10)的蛋白质含量也有所增加。数值表示平均值±SE,图中突出显示了重要的p值。
图5
图5。裸鼹鼠和小鼠肝裂解物的细胞溶质、微粒体和核组分中的特定肽酶活性表现出明显的物种差异。
尽管微粒体蛋白酶体亚组分在两种物种中具有最高活性,并且两种物种的活性相似,但细胞溶质部分存在显著差异。在这些细胞溶质组分中,裸摩尔鼠的ChT-L活性几乎高出3倍,T-L活性高出6倍。PGPH活性的比活性与ChT-L和TL的比活性呈相反趋势,小鼠的细胞溶质部分含量较高。核蛋白酶体在PGPH和ChT-L活性上显示出显著差异,但与其他组分的活性相比,其活性最小。比活度计算为每总量蛋白质的反应速率,并表示为每微克总蛋白质每1分钟释放AMC的pmol。将通过滴定测定的蛋白酶体抑制剂MG132的饱和浓度添加到平行样品中。使用抑制剂和不使用抑制剂释放的荧光的差异来测量蛋白酶体的肽水解活性。所示值代表平均值±SE。图中突出显示了显著差异及其对应的p值。
图6
图6。观察到的最大物种差异是细胞溶质部分对ChT-L和T-L活性的贡献。
使用图4所示的特定活动值计算总活动的百分比贡献。在这两种物种中,蛋白酶体活性在微粒体部分中最高,但对于ChT-L,小鼠样品(76%)中微粒体对裂解液中总活性的贡献大于裸鼹鼠样品(50%),而TL-活性的贡献差异更大(分别为87%和53%)。无论催化活性如何,核组分对这两种物种的总活性的贡献仅为7%或更少。PGPH活性在两种物种的亚细胞组分中的分布相似。与此形成鲜明对比的是,裸鼹鼠的ChT-L活性细胞溶质部分显示出比小鼠(18%)的比例贡献高出一倍多(46%),而T-L活性的物种差异更大(32%至7%)在揭示物种间观察到的总活性的分布差异时,可以用细胞溶质活性的种间差异来解释。
图7
图7。裸鼹鼠的炎症反应标记物水平高于小鼠。
我们定量了用抗NFκB和TNFα抗体探测的肝组织裂解物的Western blot分析中的蛋白质水平。在裸鼹鼠中,NFκB和TNFα蛋白水平都高出两倍以上(p≤0.01)。使用每个物种的三个不同个体的样品,并用不同动物的裂解物多次重复实验,以验证结果。所示的斑点是这些实验的代表。肌动蛋白被用作负荷对照,来自小鼠脾组织的裂解物(MsSp)代表这些免疫相关标记物的阳性对照。

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    1. Buffenstein R.寿命最长的啮齿动物裸鼠的衰老可以忽略不计:来自一个成功老化物种的见解。《复合生理学杂志》2008;178:439–445.-公共医学
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