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.2012年7月15日；523（2）：181-90。
doi:10.1016/j.abb.2012.04.018。 Epub 2012年4月30日。

蛋白酶体和免疫蛋白酶体调节剂Pa28αβ、Pa28γ和Pa200在氧化蛋白降解中的差异作用

安德鲁·M·皮克林 1, 开尔文·J·A·戴维斯
附属公司

蛋白酶体和免疫蛋白酶体调节剂Pa28αβ、Pa28γ和Pa200在氧化蛋白降解中的差异作用

安德鲁·M·皮克林等。 Arch Biochem生物物理. .

摘要

利用一个特征良好的细胞适应低浓度（1.0-10.0μM）过氧化氢（H（2）O（2））、，改变基因表达谱，增加对高水平氧化应激的抵抗力。H（2）O（2）-处理后，Pa28αβ立即与20S蛋白酶体结合，而26S蛋白酶体同时被分解。在接下来的24小时内，在H（2）O（2）-适应期间，Pa28αβ、Pa28γ和Pa200蛋白酶体调节器的水平增加，而19S调节器不变。纯化的Pa28αβ和较小程度的Pa28γ显著提高了纯化的20S蛋白酶体选择性降解氧化蛋白的能力；Pa28αβ也增加了纯化免疫蛋白酶体选择性降解氧化蛋白的能力，但Pa28γ没有。Pa200调节剂实际上降低了20S蛋白酶体和免疫蛋白酶体降解氧化蛋白的能力，但Pa200和多聚ADP核糖聚合酶可能在启动DNA修复中起协同作用。我们的结果表明，细胞质Pa28αβ和核Pa28γ可能都是蛋白酶体降解氧化损伤蛋白质能力的重要调节器，20S蛋白酶体和免疫蛋白酶体的诱导表达及其Pa28ααβ和Pa28γ调节器对氧化应激适应很重要。

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数字

图1
图1
（A） H（H）2O（运行）2暴露导致蛋白水解能力增加。用0、1、10或100μM H预处理MEF细胞2O（运行）2然后，在24小时后采集并溶解样品，并测量短肽Suc-LLVY-AMC的降解能力。数值为平均值±SE，其中n=3。（B） H（H）2O（运行）2暴露导致Pa28αβ蛋白水平增加。按A组制备样品，然后进行Western blot，用抗Pa28αβ的α亚单位或负载控制β-微管蛋白的抗体进行筛选。（C） 用siRNAs阻断20S蛋白酶体β1亚单位或Pa28ab蛋白酶体调节器表达的诱导，抑制H2O（运行）2诱导氧化应激耐受性增加，阻断细胞生长增加。用β1 siRNA、Pa28αsiRNA或干扰siRNA敲除siRNA 96小时。然后用小剂量的h2O（运行）224小时后服用毒性剂量的h2O（运行）224小时后进行细胞计数。结果为平均值±S.E.，其中n=3。
图2
图2
（A） ，在H之后2O（运行）2治疗后，Pa28αβ与20S蛋白酶体的结合增加，S4（19S亚基）结合相应减少。用1mM H处理MEF细胞2O（运行）21h后，进行抗β1免疫沉淀。样品在Western blots上运行，并筛选抗Pa28α、抗S4或抗β1的联合免疫沉淀。（B） Pa28αβ增加20S蛋白酶体降解肽底物Suc-LLVY-AMC的能力。20S蛋白酶体与4倍摩尔过量的Pa28αβ孵育30分钟。然后将Suc-LLVY-AMC添加到样品中，并测量蛋白水解能力。数值为平均值±SE，其中n=3。C.Pa28αβ增加了20S蛋白酶体选择性降解氧化血红蛋白的能力。20S蛋白酶体与4倍摩尔过量的Pa28ααβ孵育30分钟。Hb-AMC或HbOX（氧气）-然后将AMC添加到样品中，并测量蛋白水解能力。数值为平均值±SE，其中n=8。
图3
图3
（A） H（H）2O（运行）2暴露导致Pa200蛋白水平增加。用0、1、10或100μM H预处理MEF细胞2O（运行）224小时后采集样本并进行Western blot，然后用抗Pa200或负载控制β-微管蛋白的抗体进行筛选。根据β-微管蛋白带强度测量和调整样品带强度。数值为平均值±SE，其中n=3。插图显示了一个具有代表性的印迹。（B） 通过阻止Pa200的自适应增加，H2O（运行）2诱导的氧化应激耐受性增加被减弱。用Pa200或（扰乱的）siRNA处理MEF细胞24小时以阻断诱导。然后，通过使用1μM的H进行预处理，使样品暂时适应氧化应激2O（运行）2，持续1小时。在24小时的适应期后，通过100μM h的高剂量孵育对适应细胞和非适应细胞进行挑战2O（运行）224小时后使用细胞计数器进行细胞计数。结果为平均值±S.E.，其中n=3。（C） 暴露于毒性水平H2O（运行）2导致细胞核内形成Pa200病灶。MEF细胞暴露于1.0mM H2O（运行）2持续1小时。然后进行免疫细胞化学，并用抗Pa200染色细胞。（D） 暴露于低适应剂量的H2O（运行）2也导致核Pa200病灶的形成。除0、1.0μM或10.0μM H外，条件与面板C相同2O（运行）2使用了曝光。
图4
图4
（A） Pa200增加20S蛋白酶体降解肽底物Suc-LLVY-AMC的能力。20S蛋白酶体与4倍摩尔过量的Pa200孵育30分钟。然后将Suc-LLVY-AMC添加到样品中，并在接下来的4 h内测量蛋白水解能力。数值为平均值±SE，其中n=3。（B） Pa200降低20S蛋白酶体降解氧化和天然血红蛋白底物的能力。20S蛋白酶体±Pa200的制备与A组相同。Hb-AMC或HbOX（氧气）-然后将AMC添加到样品中，并在接下来的4小时内测量蛋白水解能力。数值为平均值±SE，其中n=8。（C） Pa200增强蛋白酶体降解正常组蛋白的能力，但降低蛋白酶体降解氧化组蛋白的功能。20S蛋白酶体±Pa200按A组制备，AMC标记的正常组蛋白或氧化AMC标记组蛋白用作底物。氧化组蛋白通过1mM或2mM H处理制备2O（运行）21 h。蛋白质水解值为平均值±SE，其中n=6。（D） 抗Pa200或抗β1的免疫沉淀均导致20S蛋白酶体亚单位的共同免疫沉淀，但只有抗β1抗体共同沉淀PARP。MEF细胞生长到10%的融合处，然后用抗β1抗体、抗Pa200抗体或抗孔蛋白抗体（作为非特异性结合对照）进行免疫沉淀。样品在Western blots上运行，并筛选抗β1或抗PARP的联合免疫沉淀。
图5
图5
（A） H（H）2O（运行）2暴露导致Pa28γ蛋白水平增加。用±1μM H预处理MEF细胞2O（运行）2然后，24小时后采集样品并进行Western印迹，然后用针对Pa200或负载对照β-微管蛋白的抗体对其进行筛选。（B） H（H）2O（运行）2暴露导致Pa28γ蛋白水平增加。按照图A中的方法制备MEF细胞，一式三份。然后根据β-微管蛋白带强度测量和调整样品带强度。数值为平均值±SE，其中n=3。（C） 跟随H2O（运行）2治疗后，Pa28γ与20S蛋白酶体的相关性没有改变。MEF细胞暴露于1mM H2O（运行）21h后进行抗α5免疫沉淀。样品在Western blot上运行，并筛选抗Pa28γ或抗S3（19S调节子单位）的联合免疫沉淀，作为26S蛋白酶体分解的测量。使用抗α5（未显示）作为负荷控制，以确认20S蛋白酶体的类似水平。β1印迹取自在相同条件下运行的一组单独样品。（D） Pa28γ略微增加20S蛋白酶体降解肽底物Suc-LLVY-AMC的能力。纯化的20S蛋白酶体与4倍摩尔过量的Pa28γ孵育30分钟。然后将Suc-LLVY-AMC添加到样品中并测量蛋白水解能力。数值为平均值±SE，其中n=3。（E） Pa28γ增加20S蛋白酶体降解氧化血红蛋白而非天然血红蛋白的能力。纯化的20S蛋白酶体与4倍摩尔过量的Pa28γ孵育30分钟。Hb-AMC或HbOX（氧气）-然后将AMC添加到样品中，并测量蛋白水解能力。数值为平均值±SE，其中n=8。
图6
图6
（A） MEF细胞裂解物与20S蛋白酶体亚单位β1抗体的免疫沉淀导致Pa28αβ、Pa200和Pa28γ的共沉淀。然而，免疫蛋白酶体亚单位β5i抗体的免疫沉淀导致Pa28αβ和Pa28γ弱共沉淀，而不是Pa200。使用抗β1、抗β5i或抗β-微管蛋白（作为非特异性结合的对照）抗体对MEF细胞进行免疫沉淀。免疫沉淀物通过Western blotting进行分析，并筛选样本进行抗Pa28α、抗Pa200、抗Pa28γ、抗β1或抗β5i的联合免疫沉淀。（B） Pa28αβ和Pa200（而非Pa28γ）增加免疫蛋白酶体降解肽底物Suc-LLVY-AMC的能力。免疫蛋白酶体与4倍摩尔过量的Pa28γPa28αβ或Pa200孵育30分钟。然后将Suc-LLVY-AMC添加到样品中并测量蛋白水解能力。数值为平均值±SE，其中n=3。（C） Pa28αβ（左面板）而非Pa28γ（中面板）或Pa200（右面板）的结合显著增加了免疫蛋白酶体对氧化血红蛋白的选择性降解。按照A中的方法制备样品，然后将AMC标记的血红蛋白或AMC标记氧化血红蛋白作为底物添加到样品中。数值为平均值±SE，其中n=8。
图7
图7
（A） MEF细胞裂解物与抗Pa28α、抗Pa28γ、抗Pa200或抗β1抗体的免疫沉淀导致20S和26S蛋白酶体亚单位的共同免疫沉淀，然而，当抗β1和抗Pa200拉出相当数量的S4时，抗Pa28β和抗Pa28伽马抗体在S4的共同免疫沉析中相对较差。免疫沉淀方案如图3和图4的图例所示。通过抗孔蛋白的免疫沉淀测量非特异性结合。（B）通过免疫沉淀消耗S4导致Pa28α和Pa28γ的少量损失，但Pa200的损失非常大。MEF细胞裂解物用抗S4或抗孔蛋白进行三个周期的免疫沉淀。然后取非免疫沉淀上清液并在Western blot上运行。
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