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.2012年6月；23(12):2302-18.
doi:10.1091/mbc。E11-08-0681。 Epub 2012年5月2日。

Rab11-FIP2磷酸化调节MDCK细胞的极性

林恩·拉皮埃尔 1, 肯尼亚先锋, 凯西·考德威尔, 阿斯利·奥斯坦, 杰勒德·阿波达卡, 拜伦·C·诺尔斯, 约瑟夫·罗兰, 妮可·A·杜恰姆, 詹姆斯·R·戈尔登林
附属公司

Rab11-FIP2磷酸化调节MDCK细胞的极性

林恩·拉皮埃尔等。 分子生物学细胞. 2012年6月.

摘要

Rab11效应器Rab11-家族相互作用蛋白2（Rab11-FIP2）通过与Rab11a和肌球蛋白Vb的相互作用调节细胞转染。先前的研究表明，Rab11-FIP2通过MARK2磷酸化Ser-227在Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞中建立极性。在这里，我们研究了Rab11-FIP2磷酸化对MDCK细胞极性的动态作用。在单层损伤或钙离子交换后极性重建过程中，内源性Rab11-FIP2磷酸化的Ser-227结合在泡状斑块上。非磷酸化Rab11-FIP2（S227A）的表达导致生长在Matrigel的MDCK细胞囊肿的腔形成缺失，而假定的假磷酸化Rab21-FIP2突变导致形成多腔囊肿。在渗透性滤膜上，表达Rab11-FIP2（S227E）的细胞在粘附和紧密连接的成分上都发生了变化。在粘附连接处，p120连环蛋白和K-钙粘蛋白被保留，而大多数E-钙粘素丢失。尽管ZO-1保留在紧密结合处，但闭塞素丢失，克劳丁成分改变。有趣的是，Rab11-FIP2对细胞极性的影响并不涉及肌球蛋白Vb或Rab11a。这些结果表明，Rab11-FIP2的Ser-227磷酸化调节粘附分子和紧密连接的组成，并与上皮细胞极性的调节密切相关。

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数字

图1：
图1：
在伤口愈合过程中，内源性Rab11-FIP2在Ser-227上磷酸化。MDCK细胞在融合后5天在Transwell过滤器上生长。单分子膜受伤，并在固定前恢复48小时。对细胞进行p120（合并为绿色）、Ser-227磷酸化Rab11-FIP2（合并为红色）和DAPI（合并为蓝色）染色。（A，B）不同光学变焦下单层的不同区域。B中的箭头表示带有磷酸化-S227-Rab11-FIP2的p120斑块。棒材，20μm（A），5μm（B）。
图2：
图2：
敲除MARK2可降低Ser-227上Rab11-FIP2的磷酸化。将具有MARK2敲除（MARK2 KD开启）或不具有MARK2敲除（MARK2 KD关闭）的MDCK细胞系在亚通量下铺板到盖玻片上，固定并染色磷酸-S227-Rab11-FIP2（A中的绿色）、p120（A中的红色）和DAPI（A中的蓝色）。（A） 代表性图像；底部，缩放上方方框区域。棒材，20μm（顶部），5μm（底部）。（B） 使用图像J计算的平均荧光定量。计算中使用了三个单独实验中的十二个场*p<0.0001。
图3：
图3：
虽然GFP-Rab11-FIP2（S227E）仍然与肌球蛋白Vb尾部相互作用，并且不影响IgA跨细胞作用或顶端循环，但内源性磷光体S227-Rab11-FIP2。（A） GFP-Rab11-FIP2（S22E）（合并绿色）细胞系瞬时转染樱桃肌球蛋白Vb尾（合并红色），并在Transwell过滤器上无强力霉素培养5d。固定细胞并对其进行Rab11a染色（合并为蓝色）。GFP-Rab11-FIP2（S227E）和Rab11a都被拉入Cherry肌球蛋白Vb尾区室。棒材，5μm。（B） 在酵母双杂交试验中，对Rab11-FIP2WT和Ser-227突变体进行了针对肌球蛋白Vb尾部构造和空载体的测试。所有三个Rab11-FIP2结构体都与肌球蛋白Vb尾部相互作用，但与空载体无关。（C） GFP-Rab11-FIP2（S227E）细胞系在多西环素存在（“关闭”；深蓝色和粉色线）或不存在（“打开”；黄色和浅蓝色线）的情况下，在Transwell过滤器上培养5天。左图，细胞转化试验；对，就是顶端循环分析。深蓝色和黄色线条表示培养基是从Transwell过滤器的顶部收集的，粉红色和浅蓝色线条表示培养液是从Transwell过滤器的底部收集的。（D） GFP-肌球蛋白Vb尾线在Transwell滤器上培养5 D后回流，固定并染色以检测磷酸化S227-Rab11-FIP2。pS227-FIP2在整个细胞内呈小点状结构染色，没有塌陷到GFP-肌球蛋白Vb尾部结构中。棒材，5μm。（E） MDCK细胞生长在盖玻片上，固定，并对其进行磷酸化-S227-Rab11-FIP2（合并为绿色）、肌球蛋白Vb（合并为红色）和肌动蛋白（合并为蓝色）染色。棒材，10μm。（F） 将稳定表达靶向犬肌球蛋白Vb的shRNA的MDCK细胞系与无钙培养基孵育过夜，然后切换回含钙培养基培养30分钟，固定并对其进行磷酸化S227-Rab11-FIP2和p120染色。p227-FIP2在侧膜上聚合，类似于在对照细胞中看到的情况（图4A和5A）。棒材，10μm。
图4：
图4：
内源性Rab11-FIP2在从钙开关恢复期间在Ser-227上磷酸化。GFP-Rab11-FIP2和GFP-Rab21a细胞系（合并为绿色）在无强力霉素培养基（“on”；B，C）或含强力霉素的培养基（”off”；A）中经Transwells作用后培养5d，固定并染色Ser-227磷酸化的Rab11-FIP2（合并为红色）和p120（合并为蓝色）。所检测的细胞系为（A）GFP-Rab11-FIP2（S227E）-关闭，（B）GFP-Rab11-FIP-WT-开启，（C）GFP-拉b11-FIP2（S227 E）-开启，和（D）GFP-Rab11a。左边的数字表示用含钙培养基培养细胞后的恢复时间。NS，无开关。
图5：
图5：
相应的xy公司如图3所示。内源性Rab11-FIP2在从钙开关恢复期间在Ser-227上磷酸化。GFP-Rab11-FIP2细胞系（合并时为绿色）在Transwell过滤器上培养5天，固定，并对Ser-227磷酸化的Rab11-FIP2（第一列，合并时为红色）和p120（合并中为蓝色）进行共染色。这些细胞系是（A）GFP-Rab11-FIP2（S227E）-关闭，（B）GFP-Rab11-FIP-WT-开启，（C）GFP-拉b11-FIP2（S227 E）-开启，和（D）GFP-Rab11a。棒材，10μm。左边的数字表示用含钙培养基培养细胞后的恢复时间。NS，无开关。
图6：
图6：
GFP-Rab11-FIP2野生型和突变体的过度表达改变了囊肿的形态。（A） GFP11-FIP2（S227E）细胞在含有多西环素（“off”）的Matrigel中生长14天，并对肌动蛋白（绿色合并）、足细胞粘连蛋白/gp135（红色合并）、DAPI（蓝色合并）进行染色。GFP-Rab11-FIP2-WT（B）、GFP-Rab11-FIP2（S227A）（C）和GFP-Rab11-FIP2（S227E）（D，E）细胞系在没有强力霉素（on）的情况下生长14天，并如A中所示进行染色。在GFP-Rab11-FIP2-WT细胞系中，90%的囊肿表现出单腔形态，如图所示。然而，对于GFP-Rab11-FIP2（S227A）-表达细胞，84%的囊肿具有填充的形态。在Rab11-FIP2（S227E）表达细胞中，87%的囊肿显示出多腔。（F） MDCK细胞在Matrigel中培养14天，然后进行磷酸化-S227-Rab11-FIP2（绿色合并）、podocalyxin/gp135（红色合并）和DAPI（蓝色合并）染色。相应的视频可用于GFP-Rab11-FIP2（S227E）“关闭”（补充视频S1）和GFP-Rab21-FIP2“打开”（补充图像S2和S3）细胞系以及磷化-S227-Rab1-FIP2-染色囊肿（补充视频S4）。棒材，10μm。
图7：
图7：
GFP-Rab11-FIP2野生型和突变体的过度表达改变了囊肿的早期形态。MDCK、GFP-Rab11-FIP2（S227A）和GFP11-FIP2细胞（S227E）在无强力霉素的Matrigel中培养24–48小时。对MDCK细胞进行磷酸化-S227-Rab11-FIP2染色（合并为绿色），对所有三个细胞系进行podocalyxin/gp135染色（合并时为红色）和DAPI染色（合并后为蓝色）。（A–C）双细胞期。（D–F）三细胞阶段。在GFP-Rab11-FIP2（S227A）细胞系中，75%的双细胞期囊肿和81%的三细胞期囊肿表现出如图所示的形态，而对于GFP-Rab21-FIP2细胞系（S227E），79%的双细胞阶段囊肿和78%的三胞阶段囊肿表现出了如图所述的形态。相应的视频可用于MDCK（补充视频S5和S6）、GFP-Rab11-FIP2（S227A）（补充视频S7和S8）和GFP-Rap11-FIP2（S227E）（补充图像S9和S10）细胞系。棒材，5μm。
图8：
图8：
在过表达Rab11-FIP2拟磷酸突变体的细胞中，E-钙粘蛋白从粘附连接处丢失，而K-钙粘蛋白保留。GFP-FIP2 MDCK细胞系在Transwell过滤器上培养5d后通流。（A） 固定细胞，然后对其进行E-钙粘蛋白（合并为红色）和K-钙粘素（合并为蓝色）染色。（B） 细胞按照描述生长，然后溶解，在Western blots上运行，并探测E-cadherin、K-cadherin和VDAC。使用ImageJ扫描和量化三个单独的印迹，并将其标准化为对照（VDAC）*p≤0.009（未配对学生）t吨测试。（C） 按照描述生长细胞，并通过实时PCR分离和分析RNA。结果归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），并表示为折叠变化（2-ΔΔCT).#p≤0.04。表达GFP-Rab11-FIP2-WT或GFP-Rap11-FIP2（S227Axy公司和x赫兹取光学切片。棒材，10μm。误差条表示SEM。
图9：
图9：
在紧密连接处，Z0-1被保留，但在磷酸化Rab11-FIP2（S227E）细胞系中，闭塞素丢失。（A） 表达GFP-Rab11-FIP2-WT或GFP-Rap11-FIP2（S227E）（合并为绿色）的稳定MDCK细胞系在Transwell滤纸上培养5d，固定并染色ZO-1（合并为红色）和闭塞素（合并为蓝色）。（B） 细胞按照描述生长，然后溶解，在Western blots上运行，并探测闭塞素和VDAC。扫描三个单独的印迹，用ImageJ定量，并归一化为对照（VDAC）*p=0.0001由未配对学生t吨测试。（C） 按照描述生长细胞，并通过实时PCR分离和分析RNA。结果被归一化为GAPDH，并表示为折叠变化（2-ΔΔCT). （D） TER测量。尽管所有处于“开启”状态的细胞株的TER都有所下降，但任何“开启”细胞株和“关闭”细胞株之间都没有显著差异。箭头（A）表示xy公司和x赫兹取光学切片。棒材，10μm。误差条表示SEM。
图10：
图10：
GFP-Rab11-FIP2-WT或GFP-Rap11-FIP2（S227E）的过度表达改变了紧密连接的克劳丁含量。GFP-Rab11-FIP2-WT-on和GFP-Rap11-FIP2（S227E）-on和-off在Transwell过滤器上生长5 d后通量。固定细胞，然后对其进行claudin-1（A）、claudin-2（B）或claudin-4（C）和ZO-1染色。在合并后的图像中，GFP-Rab11-FIP2为假绿色，克劳丁为红色，ZO-1为蓝色。（D） 细胞按照描述生长，然后裂解，在Western blots上运行，并探测不同的克劳丁和VDAC。使用ImageJ扫描并量化三个单独的印迹，并将其归一化为对照（VDAC）*未配对学生的p≤0.004t吨测试。（E） 按照描述生长细胞，并通过实时PCR分离和分析RNA。将结果归一化为GAPDH，并表示为折叠变化（2-ΔΔCT). 棒材，10μm。误差条表示SEM。
图11：
图11：
GFP-Rab11a或GFP肌球蛋白Vb尾部的过度表达不会破坏顶端连接处的E-钙粘蛋白或occludin。在Transwell过滤器上培养过度表达GFP-Rab11a或GFP-肌球蛋白Vb尾部或瞬时转染GFP-Rap11aS25N的稳定MDCK细胞5d。固定细胞，然后染色（A）E-cadherin（合并为红色）和K-cadherin/cadherin-6（合并为蓝色）或（B）闭塞素（合并为红）和ZO1（合并为蓝）。两种细胞系中E-cadherin和闭塞素均未发生改变。棒材，10μm。
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