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.2012年6月8日;287(24):20674-88.
doi:10.1074/jbc。M111.280651。 Epub 2012年4月25日。

与小窝蛋白-1相互作用调节小鼠β3-肾上腺素受体G蛋白偶联

附属公司

与小窝蛋白-1相互作用调节小鼠β3-肾上腺素受体G蛋白偶联

佐藤Masaaki等。 生物化学杂志. .

摘要

Caveolins作为多蛋白复合物中的支架蛋白,与G蛋白偶联受体的信号传递有关。用敲除小鼠进行的研究表明,β(3)-肾上腺素受体(β(3AR)信号传导依赖于小窝蛋白-1;然而,目前尚不清楚caveolin-1是与β(3)-AR相关还是仅与下游信号蛋白相关。我们通过研究膜筏和小窝蛋白-1对小鼠β(3a)-和β(3b)-AR亚型差异信号传导的影响来解决这个问题,这些亚型在远端C末端发散。只有β(3b)-AR促进百日咳毒素(PTX)敏感性cAMP的积累。当表达β(3a)-AR的细胞用filipin III处理以破坏膜筏或用caveolin-1 siRNA转染时,对β(3)-AR激动剂CL316243的环AMP反应变得PTX敏感,表明Gα(i/o)偶联。β(3a)-AR C末端SP(384)PLNRF(389)DGY(392)EGARPF(398)PT类似于小窝蛋白相互作用基序。突变体β(3a)-AR(F389A/Y392A/F398A或P384S/F389A)促进PTX敏感性cAMP反应,原位邻近性分析表明小窝蛋白-1与野生型β(3a-AR之间存在关联,但与突变体受体无关。在膜制备中,β(3b)-AR激活Gα(o)并介导PTX敏感性cAMP反应,而β(3a)-AR不激活Gα蛋白(i/o)。内源性β(3a)-AR在小窝蛋白-1基因敲除小鼠棕色脂肪细胞或经filipin III治疗的野生型脂肪细胞中显示Gα(i/o)偶联。我们的研究表明,β(3a-AR与小窝蛋白的相互作用抑制Gα(i/o)的偶联蛋白,提示信号传导由富含筏的复合物调节,该复合物包含β(3a)-AR、小窝蛋白-1、Gα(s)和腺苷酸环化酶。

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数字

图1。
图1。
β激活后的功能反应-AR同种型。 A类,β的C末端尾部的蛇图-AR亚型。注意,截断的突变体终止于残基Asn-387。B–D类,β刺激cAMP积累的浓度响应曲线3a年-应收账款(B类), β3亿-应收账款(C类),和截断的β-应收账款(D类)在存在或不存在PTX预处理(100ng/ml、16h)的情况下。稳定表达每个β的CHO-K1细胞-AR在含有0.5 m的刺激缓冲液中暴露于CL316243 30 minIBMX抑制磷酸二酯酶。对福斯科林的反应(10−4 )与每批细胞的激动剂刺激cAMP积累平行测定,结果以forskolin反应的百分比表示。基础cAMP和对100μ福斯科林(fsk公司)对照组基础0.33±0.13和fsk 17.2±4.2pmol/104细胞+PTX基础0.33±0.13和fsk 18.1±5.5 pmol/104单元格(B类); 对照基础0.27±0.16和fsk 22.4±4.2pmol/104细胞+PTX基础0.41±0.12和fsk 21.8±2.7 pmol/104单元格(C类); 对照基础0.78±0.21和fsk 22.5±4.1 pmol/104细胞+PTX基础0.68±0.17和fsk 23.1±3.3 pmol/104单元格(D类). 在表达β3亿-AR和截断受体(第页<0.001由双向方差分析确定),但不包括β3a年-阿。数值为4-5个独立实验的平均值±S.E。
图2。
图2。
filipin III对小窝的破坏改变了β-AR亚型。构建浓度响应曲线,以刺激CL316243在存在或不存在filipin III(1μg/ml,1 h)或用PTX预处理细胞后(100 ng/ml,16 h)的cAMP积累。在稳定表达β3a年-PTX治疗未改变AR、cAMP的积累(A类),但添加filipin III导致反应对PTX敏感(B类,第页<0.001,通过双向方差分析确定)。在表达β3亿-AR亚型,filipin III对PTX敏感性没有显著影响(C类D类). 基础cAMP和对100μfsk为对照组基础1.23±0.47,fsk为24.4±9.7 pmol/104细胞+PTX基础0.85±0.36和fsk 24.6±10.4 pmol/104单元格(A类); 对照基础1.45±0.64和fsk 23.0±9.5pmol/104细胞+PTX基础1.35±0.62和fsk 22.5±10.6 pmol/104单元格(B类); 对照基础1.06±0.40和fsk 23.1±8.3pmol/104细胞+PTX基础1.35±0.55和fsk 27.1±9.3 pmol/104单元格(C类); 对照组基础2.56±0.88和fsk 27.0±9.6pmol/104细胞+PTX基础2.29±0.80和fsk 26.1±9.5 pmol/104单元格(D类).B类D类,星罗棋布的线显示了CL316243在没有菲利平III或PTX预处理的情况下的浓度响应曲线,取自A类C类分别用于比较。CHO-β3a年-AR细胞filipin III导致曲线右移,而CHO-β3亿-AR细胞、基础和最大cAMP积累增加,但CL316243的效力没有变化。结果表示为对forskolin反应的百分比(10−4 ),值为4-6个独立实验的平均值±S.E。
图3。
图3。
siRNA敲除小窝蛋白-1影响β介导的反应3a年-但不是β3亿-阿。 A类使用小窝蛋白-1抗体通过免疫印迹蛋白提取物测试siRNA结构(左侧面板)或β-肌动蛋白抗体(右侧面板). 在免疫印迹之前,对等量的细胞裂解液进行10%的SDS-PAGE。近似分子质量显示在左边单位:kDa。显示了来自四个实验的典型免疫印迹。这个左侧面板与表达β3a年-AR或β3亿-阿根廷。B–E类,构建了CL316243刺激稳定表达β的CHO-K1细胞中cAMP积累的浓度响应曲线3a年-或β3亿-AR和瞬时转染阴性对照(CTL公司)或caveolin-1(洞穴-1)siRNA构建。基础cAMP和对100μfsk在对照基础上分别为1.47±0.33和27.9±3.7pmol/104细胞+PTX基础1.49±0.24和fsk 25.4±5.6 pmol/104单元格(B类); 对照基础0.97±0.19和fsk 22.0±3.5pmol/104细胞+PTX基础1.22±0.09和fsk 24.2±2.9 pmol/104单元格(C类); 对照基础1.08±0.47和fsk 21.7±2.0pmol/104细胞+PTX基础1.75±0.73和fsk 23.0±2.3 pmol/104单元格(D类); 对照基础0.76±0.23和fsk 26.7±4.1 pmol/104细胞+PTX基础0.65±0.29和fsk 22.6±4.8 pmol/104单元格(E类). CHO-β3a年-AR细胞,caveolin-1的敲低导致cAMP积累变得对PTX敏感(B类,第页<0.001(通过双向方差分析确定),而阴性对照siRNA没有影响(C类). CHO-β3亿-AR细胞,小窝蛋白-1 siRNA和阴性对照siRNA均未对PTX敏感性产生任何影响(D类E类). 结果表示为对forskolin反应的百分比(10−4 ),值为六个独立实验的平均值±S.E。
图4。
图4。
β中假定位点的定点突变3a年-与小窝蛋白-1相互作用的AR C末端。所有相关小鼠β的C末端序列-AR亚型和突变体,以及大鼠β-AR,如所示A类384位的残基和389、392和398位的芳族残基是装箱的构建浓度-响应曲线,以刺激CL316243在瞬时转染突变β3a年-AR。PTX预处理(100 ng/ml,16 h)增加了表达P384Sβ3a年-应收账款(B类),P384S,F389Aβ3a年-应收账款(D类)、F389A、Y392Aβ3a年-应收账款(E类)或F389A、Y392A、F398Aβ3a年-应收账款(F类)突变体(第页<0.001(通过双向方差分析确定),但不包括A395Eβ-应收账款(C类). 基础cAMP和对100μfsk如下:B类,控制基础0.13±0.03和fsk 9.3±2.3 pmol/104细胞+PTX基础0.16±0.06和fsk 9.9±2.5 pmol/104细胞;C类,控制基础0.58±0.25和fsk 8.5±1.1 pmol/104细胞+PTX基础0.18±0.07和fsk 8.1±1.3 pmol/104细胞;D类,控制基础0.11±0.02和fsk 12.6±5.9 pmol/104细胞+PTX基础0.08±0.01和fsk 11.5±5.5 pmol/104细胞;E类,控制基础0.17±0.05和fsk 8.5±0.9 pmol/104细胞+PTX基础0.19±0.05和fsk 10.0±1.3 pmol/104细胞;F类,控制基础0.60±0.24和fsk 9.1±4.3 pmol/104细胞+PTX基础0.87±0.44和fsk 10.0±4.3 pmol/104细胞。结果表示为对forskolin反应的百分比(10−4 ),值为4-6个独立实验的平均值±S.E。这个389P(P)XXXX年F类389XX年Y(Y)392基序似乎在调节Gα中占主导地位输入/输出β的耦合-AR亚型。
图5。
图5。
检测β之间的相互作用-使用Duolink的AR和caveolin-1TM(TM)就地邻近连接试验。 A类,未转染CHO-K1细胞;B类,CHO-K1细胞表达野生型β3a年-AR;C类、F389A、Y392A、F398Aβ3a年-AR;D类,P384S,F389Aβ第3页-阿根廷。细胞固定在玻片上并与抗β-AR和抗小窝蛋白-1一级抗体,然后PLA探针MINUS和PLUS二级抗体,如“实验程序”所述。然后用含有适当寡核苷酸的杂交溶液处理细胞,如果两个PLA探针非常接近,则将其杂交到两个PLA-探针。将杂交寡核苷酸连接并进行滚圈扩增,然后使用荧光标记的寡核苷酸检测级联产物。检测溶液中还含有Hoechst 33342核染色剂。清洗后,使用徕卡DMLB外荧光显微镜检测荧光。照片是在×63倍放大率下拍摄的,图像是使用DC350F相机和IM500软件(徕卡微系统公司AB)采集的。表达野生型β的细胞3a年-AR显示强烈的红色荧光,表明与小窝蛋白-1的相互作用(B类)而非转染细胞或表达F389A、Y392A、F398A突变的细胞没有信号(A类C类). 在表达P384S、F389Aβ的细胞中可检测到荧光3a年-AR,表明caveolin-1相互作用较弱(D类).E类每个受体的表达和β的识别-AR抗体通过使用β-AR抗体(上部面板)或t-Akt抗体(下部面板). 样品编号如下:车道1,未转染CHO-K1细胞;车道2,野生型β3a年-AR;车道3、F389A、Y392A、F398Aβ3a年-AR;车道4,P384S,F389Aβ3a年-AR;车道5, β3亿-阿根廷。近似分子质量显示在左边单位:kDa。注意野生型和突变型β3a年-AR由β识别-AR抗体,而β3亿-AR不与该抗体发生交叉反应。
图6。
图6。
filipin III破坏小窝改变表达内源性β3a年-AR。构建浓度响应曲线,以刺激CL316243的cAMP积累或在有或无filipin III(1μg/ml,1 h)或用PTX预处理细胞后的葡萄糖摄取(100 ng/ml,16 h)。在棕色脂肪细胞中,PTX处理不会改变cAMP的积累(A类),但添加了filipin III(B类)显著降低了最大响应(第页<0.0001),但也导致反应变得对PTX敏感(第页<0.001,通过双向方差分析确定)。cAMP积累表示为对forskolin(10)反应的%−4 ),和值是七个独立实验的平均值±S.E。基础cAMP和对100μfsk如下:A类对照基础1.3±0.4和fsk 12.2±1.3 pmol/孔+PTX基础1.1±0.3和fsk 12.0±2.7 pmol/孔;B类,filipin III基底1.2±0.2和fsk 13.9±2.1 pmol/孔+PTX基础1.3±0.3和fsk 14.0±1.7 pmol/孔。对下游反应,即葡萄糖摄取的检查,以基础的%表示,也表明缺乏PTX敏感性(C类)., 而filipin III治疗(D类)导致浓度响应曲线向右显著偏移,PTX预处理使其向左显著偏移(第页<0.001,通过双向方差分析确定)。数值为8-13个独立实验的平均值±S.E。对照组基础葡萄糖摄取量和对CL316243的最大反应为810±64,最大1411±118 dpm/孔+PTX基础760±82,最大1332±107 dpm/孔(C类); filipin III基底1076±121,最大1547±164 dpm/孔+PTX基础883±115,最大1475±92 dpm/孔(D类).B类D类,虚线显示了CL316243在不进行菲利平III或PTX预处理的情况下的浓度响应曲线,用于比较A类C类分别是。
图7。
图7。
从小窝蛋白-1基因敲除小鼠分离的棕色脂肪细胞显示出改变的信号特征。构建浓度响应曲线,以刺激CL316243在野生型(+/+,A类)或caveolin-1击倒(−/−,B类)老鼠。PTX预处理脂肪细胞(100 ng/ml,16 h)增加了小窝蛋白-1脂肪细胞中CL316243刺激的cAMP积累−/−老鼠(第页<0.05,通过双向方差分析确定),但在野生型小鼠中没有。结果表示为对毛喉素反应的百分比(10−4 ),值为6-7个独立实验的平均值±S.E。基础cAMP和对100μfsk如下:A类控制基础0.70±0.26和fsk 16.7±2.0pmol/孔+PTX基础0.42±0.25和fsk 15.8±2.5 pmol/孔;B类基础0.45±0.20和fsk 14.5±3.4 pmol/孔+PTX基础0.55±0.24和fsk 14.3±3.2 pmol/孔。
图8。
图8。
从表达β3a年-AR或β3亿-AR表现出明显的受体偶联和信号转导。构建了由CHO-β制备的膜对CL316243刺激的cAMP积累的浓度响应曲线3a年-应收账款(A类)或CHO-β3亿-AR细胞(B类). 为了测试PTX的效果,在室温下用活化PTX(20μg/ml)处理膜15分钟。数据表示为cAMP/μg蛋白质的pmol,不校正基础cAMP水平。数值为一式三份进行的4-6次实验(使用独立的粗膜制剂)的平均值±S.E。C类显示了来自CHO-β膜的每个浓度响应曲线的数据,表示为最大cAMP积累减去基础cAMP3a年-或CHO-β3亿-AR细胞。CL316243诱导的cAMP在β3a年-经或不经PTX处理的AR膜无显著差异。相反,经PTX处理的β3亿-AR细胞与未处理的细胞膜相比,CL316243诱导的最大cAMP反应显著增加(第页<0.001,Newman Keuls多重比较试验的单因素方差分析)。[35S] 采用GTPγS免疫沉淀法评估Gα的直接激活(D类),Gαi1号机组(E类),Gαi2类, (F类),Gαi3类(G公司),或Gαo(o)(H(H))β刺激后3a年-AR(在CHO-K1细胞或BAT中)或β3亿-AR在CHO-K1细胞中表达。含有100 fmol的反应[35S] 100μl中的GTPγS。数据表示为[35S] GTPγS;值是4-6个实验的平均值±S.E.(使用独立的粗膜制剂)。3 μCL316243刺激Gα显著增加所有三种膜样品(**,第页<0.01;*,第页< 0.05; 采用Bonferroni多重比较测试的双向方差分析)。CHO-β3亿-AR膜也显示出Gα的显著增加o(o)激活(**,第页< 0.01; 采用Bonferroni多重比较测试的双向方差分析)。,β的预处理3亿-活化PTX的AR膜消除了Gαo(o)激活但对Gα没有显著影响激活(***,第页< 0.001; **,第页<0.01,对车辆的反应显著不同;^^,第页<0.01,PTX存在下的CL316243反应与未处理膜中的CL316233反应显著不同;采用Bonferroni多重比较测试的双向方差分析)。

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