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.2012年6月；23(12):2373-87.
doi:10.1091/mbc。E12-01-0060。 Epub 2012年4月25日。

Ras样蛋白R-Ras2/TC21对乳腺的正常发育很重要

罗曼·拉里夫 1, 安东尼奥·阿巴德, 克拉拉·卡达巴, 特蕾莎·埃尔南德斯, 玛尔塔·卡纳梅罗, 恩里克·德·阿尔熔岩, 尤金尼奥·桑托斯, 巴尔比诺·阿拉孔, XoséR Bustelo公司
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Ras样蛋白R-Ras2/TC21对乳腺的正常发育很重要

罗曼·拉里夫等。 分子生物学细胞. 2012年6月.

摘要

R-Ras2/TC21是一种与Ras亚家族成员具有高序列和信号相似性的GTPase。尽管已经使用细胞系中的过表达研究对其进行了广泛研究，但其生理作用的特征仍然很差。在这里，我们使用在内源性RRas2启动子调控下表达β-半乳糖苷酶的RRas2基因敲除小鼠来研究该GTPase在体内的功能。尽管RRas2（-/-）小鼠在组织中的表达对机体的生存能力至关重要，但在生存能力、生长速度、心血管参数或生育能力方面没有重大变化。相比之下，它们在青春期的乳腺发育中表现出明显而特殊的缺陷。在缺乏R-Ras2/TC21的情况下，该腺体形成的终末芽（TEB）和导管分支数量减少，导致乳腺脂肪垫中腺体树的延伸和树状化出现暂时延迟。这种表型与TEB中存在的上皮细胞的细胞自主增殖缺陷有关。这些细胞还显示Erk活化减少，但磷酸化Akt的野生型水平降低。使用化合物RRas2-、HRas-和NRas-敲除小鼠，我们证明这些GTPase在这一形态发生过程中以非协同和非加性方式发挥作用。

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图1：
图1：
RRas2型小鼠胚胎发育过程中的基因表达。（A–F）E10.5（A，B）、E11.5（C，D）和E13.5（E，F）的全贴装X-gal染色RRas2号机组+/−胚胎显示（蓝色）RRas2型基因。心脏（A–D，F）、指间区（F）和脊髓（E）分别用实心箭头、黑色箭头和开放箭头表示。比例尺，1 mm。（G，H）X-gal的矢状截面-染色E14.5（G）和E16.5（H）RRas2号机组−/−胚胎。比例尺，1 mm。在C–E中，头部区域的信号是由于X-gal染色的非特异性扩散所致。在G中，闭合箭头和开放箭头分别表示心室和心房。在H中，闭合箭头和开放箭头分别表示心室和肠道。黑色和白色箭头分别表示胸腺和肺。（I–L）X-gal/伊红染色E16.5中心脏（I）、胸腺（J）、肺（K）和肠（L）区域的放大RRas2号机组+/−胚胎。比例尺，50μm。E16.5的胸部（带[M，插图]或不带胸腺[M，主面板]）和腹部（N）区域的（M，N）图像RRas2号机组−/−胚胎全部用X-gal染色。a、 主动脉；b、 膀胱；i、 肠；l、 肝脏；la，左心房；肺；左心室；pa，肺动脉；ra，右心房；rv，右心室；t、 胸腺。比例尺，500μm。
图2：
图2：
的表达式RRas2号机组成年小鼠组织中的基因。（A） 使用来自3个月大鼠指示组织（底部）的总RNA进行qRT-PCR分析RRas2号机组+/+鼠标。BAT，棕色脂肪组织；BG，球鼻腺；SSM，横纹肌；WAT，白色脂肪组织。表达式值是相对于RRas2型乳腺中的转录本（任意值为1）。考虑到内务管理的表达水平，对所有值进行了规范化Gapdh公司每个样本中的mRNA。a.u.，任意单位。（B–K）冷冻切片取自3个月大鼠的肺（B，C）、睾丸（D）、卵巢黄体（E）、白色脂肪组织（F）、心脏（G）、主动脉（H）、乳腺（I）、十二指肠（J）和膀胱（K）RRas2号机组+/−小鼠进行X-gal染色（蓝色），并用曙红（紫色）进行复染。在B和C中，闭合箭头和星号分别表示平滑肌细胞和肺泡细胞。在C中，开放箭头表示分散的X-gal阳性上皮支气管细胞。在H中，闭合箭头和星号分别表示血管内皮细胞和平滑肌细胞。在I中，闭合的箭头表示肌上皮细胞的外导管层。在J和K中，闭合的箭头和星号分别表示上皮细胞和肌肉细胞层。比例尺，50μm。
图3：
图3：
R-Ras2/TC21调节青春期乳腺的适时发育。（A） 对从指定阶段提取的乳腺中获得的总RNA进行qRT-PCR分析。青春期前、青春期和成年处女对应于从3周、8周和14周龄的婴儿中采集的样本RRas2号机组+/+雌性小鼠。妊娠早期和晚期分别对应于怀孕1周和2½周内的雌性小鼠。分别于分娩后1周和2周采集早期和晚期泌乳样品。在断奶后3.5天采集退化期样本。数据是相对于处女成体状态下获得的表达水平给出的（任意值为1）。考虑到内务管理的表达水平，对所有值进行了规范化Gapdh公司每个样本中的mRNA*p≤0.05***p≤0.001（n=3）。（B） 从指定年龄（顶部）和基因型（左侧）的雌性小鼠获得的胭脂红明矾染色乳腺脂肪垫的代表性图像。比例尺，500μm。腹股沟淋巴结之一用白色星号表示。（C–F）从指定基因型和年龄的动物身上获得的乳腺总面积（C）、最大长度（D）、TEB数量（E）和分支点（F）的量化*与适当的野生型对照组获得的值相比，p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001（n=每个基因型和发育阶段5-10只动物）。
图4：
图4：
R-Ras2/TC21缺陷小鼠乳腺的发育缺陷是由于MEC中固有的信号缺陷所致。（A） 所示基因型的受体雌性小鼠（左）原位移植原代乳腺上皮细胞后发育的乳腺代表性图像（上）。这些包括控制（左）和RRas2号机组−/−移植前用非编码慢病毒转导的（中间）细胞RRas2号机组−/−用编码人类R-RAS2/TC21蛋白的HA标记版本的慢病毒转导的细胞（右）。移植后7周，分离乳腺脂肪垫，用胭脂红明矾染色并拍照。比例尺，500μm。（B） A.*p≤0.05所述移植实验中乳腺所占总面积的量化**p≤0.01（n=5-8）。（C） 通过Western blot（WB）和HA抗体（top）分析所示乳腺上皮细胞培养物的总细胞提取物，以揭示异位HA-RAS2/TC21蛋白的表达。作为负荷对照，用微管蛋白α抗体对相同提取物进行免疫印迹（底部）。
图5：
图5：
R-Ras2/TC21在青春期乳腺发育期间与H-和N-Ras GTPase无重复和非加性作用。（A） 从指定年龄（顶部）和基因型（左侧）的雌性小鼠获得的胭脂红明矾染色乳腺脂肪垫的代表性图像。比例尺，500μm。（B–E）量化从指定基因型和年龄的动物获得的乳腺的总面积（B）、最大长度（C）、TEB数量（D）和分支点（E）*与适当的野生型对照组获得的值相比，p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001（n=5-11只动物/基因型和发育阶段）。
图6：
图6：
的表达式RRas2号机组青春期乳腺中的基因。（A） 6周龄婴儿的乳腺切片RRas2号机组−/−雌性小鼠用X-gal（蓝色）和平滑肌细胞肌动蛋白抗体（棕色）染色，并用核固红（紫色）复染。左图为风管的代表性图像；中间和右边的两个不同方向的TEB。黑色箭头表示肌上皮细胞X-gal和平滑肌细胞肌动蛋白双重阳性。闭合箭头表示帽细胞X-gal和平滑肌细胞肌动蛋白双重阳性。打开的箭头可精确定位单个X-gal阳性体细胞。比例尺，50μm。（B） 指示的表达式Ras公司原代乳腺上皮细胞中的家族转录物来源于指定的基因型。数值是相对于野生型小鼠中每个转录物的表达水平给出的（任意值为1）。n=1个实验，一式三份。（C） Western blot分析显示内源性R-Ras2/TC21蛋白在原代乳腺上皮细胞中的表达（顶部）。作为负载对照，使用微管蛋白α抗体对相同提取物的等分试样进行免疫印迹分析（底部）。
图7：
图7：
青春期上皮细胞增殖减少和Erk激活RRas2号机组−/−乳腺。（A） 对所示基因型（顶部）的5周龄动物的乳腺进行切片，用平滑肌细胞肌动蛋白抗体（SMA，红色）染色，用4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）孵育，并用免疫荧光显微镜进行分析。图片显示了TEB的代表性部分。大写单元格用开放箭头表示。比例尺，100μm。（B，C）使用Ki67抗体对所示基因型（top）的5周龄动物的乳腺进行免疫组织化学分析，并用标准光镜（B）进行分析，以量化TEB和周围基质中Ki67阳性细胞的数量（C）。比例尺，100μm**与适当的野生型对照相比，p≤0.01（n=6–8）。（D，E）对所述获得的乳腺进行TUNEL分析，并通过免疫荧光（D）进行分析，同时对TEB中出现的凋亡TUNEL阳性细胞数量进行量化（E）。比例尺，100μm。（F–I）用磷酸化Akt（F）或磷酸化Erk1/2（H）抗体对从所示基因型小鼠获得的乳腺进行免疫染色，以量化TEB和邻近基质中存在的磷酸化Akt阳性（G）和磷酸化Erk1/2阳性（I）细胞的百分比。p、 磷。G和H中的比例尺，100μm。在I中，***p≤0.001，与野生型小鼠的值相比（n=5）。
图8：
图8：
体外增殖缺陷RRas2号机组−/−初级乳腺上皮细胞。（A，B）使用标准细胞数（A）和BrdU掺入（B）测定实验测定指定基因型的原代乳腺上皮细胞的增殖***与对照细胞（n=3）中获得的值相比，p≤0.001。外径、光密度。（C） 原发性乳腺上皮细胞，来源于RRas2号机组−/−用空慢病毒转导小鼠(RRas2号机组−/−)或编码HA-RAS2/TC21蛋白的慢病毒(RRas2型−/−+RRAS2（RRAS2）)以及使用BrdU掺入分析测定的增殖。作为对照，我们同时测定了模拟感染的野生型乳腺上皮细胞的增殖(RRas2号机组+/+). ***与模拟转导中获得的值相比，p≤0.001RRas2号机组−/−细胞（n=3）。（D，E）将所示的乳腺上皮细胞（顶部）嵌入Matrigel中，并在饥饿培养基（SM）或生长培养基（GM）中培养10天。在每个实验时间点，拍摄培养物（D），并测定形成的菌落体积（E），如材料和方法在D中，比例尺为50μm。在E中，与模拟感染相比，*p≤0.05和**p≤0.01RRas2号机组−/−细胞（n=3）。（F，G）所示基因型的乳腺上皮细胞（左）保存在含有饥饿培养基（F，左）、含有DMSO载体的生长培养基（F，中）或添加PD98059 MEK抑制剂的生长培养液（F，右）的Matrigel培养基中。10天后，对形成的菌落拍照（F）并测定其体积（G）。在F中，比例尺为50μm。在G中，***p≤0.001（n=3）。（H） Western blot分析显示在上述实验中使用的适当实验样品中异位HA-RRAS2/TC21蛋白的表达（顶部）。作为负荷控制，用微管蛋白α抗体对相同提取物的等分样品进行免疫印迹分析（底部）。
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