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.2012年6月22日；287(26):22184-95.
doi:10.1074/jbc。M112.366179。 Epub 2012年4月18日。

LINGO-1是一种跨膜信号蛋白，通过细胞间自我作用抑制少突胶质细胞分化和髓鞘形成

斯科特·杰普森 1, 布莱恩·沃特, 克里斯蒂安·H·格罗斯, 鲁甘, 道格拉斯·奥斯汀, J丹尼尔·弗兰茨, 雅克·兹瓦伦, 洛伊, 威廉·马克兰, 劳尔·克劳斯
附属公司

LINGO-1是一种跨膜信号蛋白，通过细胞间自我作用抑制少突胶质细胞分化和髓鞘形成

斯科特·杰普森等人。 生物化学杂志. .

摘要

克服再髓鞘化失败是多发性硬化等脱髓鞘疾病新疗法的主要目标。LINGO-1是髓鞘形成的关键负调控因子，是一种在神经元和少突胶质细胞中表达的跨膜信号蛋白。在神经元中，LINGO-1是Nogo受体复合物的一个组成部分，该复合物通过RhoA抑制轴突生长。由于该复合物的唯一配体结合亚单位Nogo受体在少突胶质细胞中缺失，因此通过LINGO-1介导机制抑制髓鞘形成的细胞外信号尚不清楚。在这里，我们表明LINGO-1通过细胞间相互作用抑制少突胶质细胞末端分化，并且能够在反式中自我结合。与以前的报道一致，全长LINGO-1的过度表达抑制了少突胶质前体细胞（OPC）的分化。出乎意料的是，在与背根神经节神经元共培养的过程中，用可溶性重组LINGO-1胞外区治疗也对OPC产生抑制作用，并减少有髓轴突段。我们通过使用在星形胶质细胞中体外表达的表面结合LINGO-1结构，证明LINGO-1通过细胞间信号传导介导对OPC的抑制。进一步研究表明，可溶性LINGO-1外结构域可以通过与表达全长LINGO-1的CHO细胞结合，在反式中与自身相互作用。最后，我们观察到可溶性LINGO-1可以激活OPC中的RhoA。我们认为LINGO-1既是配体又是受体，其负调控OPC分化和髓鞘形成的机制是由嗜同性细胞间相互作用介导的。这种蛋白-蛋白质相互作用的破坏可能导致LINGO-1抑制作用的降低和髓鞘形成的增加。

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数字

图1。
图1。
OPC成熟过程中LINGO-1表达降低在体外.新生大鼠OPC在PDGF/FGF中生长3天，如“实验程序”所述。移除PDGF/FCF并替换为10 ng/ml CNTF和15 n米T3延长4天，促进少突胶质细胞分化。A类用免疫细胞化学和荧光显微镜观察NG2和MBP对OPC分化的影响。B类培养大鼠OPC的代表性Western blot分析显示，MBP蛋白表达增加，与LINGO-1表达减少相关，因为细胞在没有或存在CNTF/T3的情况下分化4天。C类MBP和LINGO-1表达变化的四个独立实验的密度定量，归一化为GAPDH。表达以PDGF/FGF中水平的百分比表示。嗯，LINGO-1高分子量条带；LMW公司，LINGO-1低分子量条带；MBP公司, *,对<0.05 Bonferroni事后检验的单因素方差分析；LINGO-1、**、，对< 0.01; ***,对<0.001双向方差分析，采用Bonferroni事后检验。
图2。
图2。
LINGO-1的过度表达阻止OPC成熟。大鼠和小鼠OPC培养物感染表达全长LINGO-1的慢病毒构建物(FL-LINGO公司)，一种截短型，包含LINGO-1的细胞外和跨膜结构域(ECTO-LINGO公司)或控制病毒(CTRL病毒)，如“实验程序”所述。去除PDGF/FGF后，在不存在或存在1ng/ml CNTF和1.5ng/ml CNTF的情况下，对大鼠和小鼠分别额外处理4天和6天米T3。A类对感染2.5 m.o.i.大鼠OPC的八个独立实验进行的代表性Western blot分析表明，FL-LINGO-1或ECTO-LINGO1的过度表达阻止了MBP的表达。每个面板包含在同一凝胶上运行的样品。B类如图所示，在0.5和2.5 m.o.i.感染的小鼠OPC的代表性Western blot分析也显示，在这两种LINGO-1结构过度表达后MBP表达降低。GAPDH被用作Western blot分析的负荷控制。C类MBP表达的定量免疫荧光显微镜证实，FL-LINGO和ECTO LINGO降低了小鼠OPC的分化。数据代表了三个实验。数值为四种重复培养物/条件的平均值±S.E.。*，对<0.05，采用Bonferroni事后检验进行单因素方差分析。D类MBP染色的感染小鼠培养物中少突胶质细胞分化的代表性图像显示成熟细胞数量减少。
图3。
图3。
可溶性LINGO-1外结构域阻止少突胶质细胞成熟。新生大鼠OPC培养物在含有PDGF/FGF的培养基中培养4天，然后用50μg/ml重组可溶性LINGO-1胞外区处理4天(B–D类)或按指示剂量(A类)去除PDGF/FGF并添加1 ng/ml CNTF和1.5 n后米T3。A类，五个独立实验的代表性蛋白质印迹分析显示暴露于可溶性LINGO-1后MBP蛋白表达量的剂量响应性降低。这个图表在中右侧面板表示归一化为GAPDH的MBP带的密度定量。数值表示为CNTF/T3中水平的百分比。B类MBP的定量免疫荧光显微镜分析显示，可溶性LINGO-1胞外结构域处理可阻止OPC分化。数据代表了三个实验。*，对<0.05单因素方差分析，采用Bonferroni事后检验。C类和D类对大鼠OPC培养物进行O4和MBP双重免疫染色。视觉(C类)和定量(D类)免疫荧光显示可溶性LINGO-1的作用仅限于降低MBP的表达(绿色单元格)并且不影响O4的表达(红细胞). 这个箭头在里面C类指示O4+/MBP公司+双标记细胞。数据代表了两个实验。定量免疫荧光显微镜值如图2.*所示，对<0.05，学生t吨测试。
图4。
图4。
可溶性LINGO-1外结构域可防止髓鞘形成。如图所示，将两周龄的DRG培养物与新生大鼠OPC在DAPT或可溶性LINGO-1外结构域的存在下共同培养2周。A类，通过荧光显微镜评估的髓鞘形成的代表性图片显示，MBP+线性段束与对照培养物中的神经丝H识别的轴突对齐(左侧面板). 添加2μ米DAPT增加髓鞘形成(右侧面板)而与50μg/ml可溶性LINGO-1外结构域孵育可阻止这些培养物中有髓轴突的出现(中央面板).比例尺=40微米。B类两名经过训练的独立观察者用荧光显微镜对髓鞘形成进行盲法评估，并在高功率场（场面积65μm×65μm）中计数MBP+髓鞘片段。数值代表两个独立实验中重复井至少18个油田的平均值±S.E.。***，对<0.001单因素方差分析，采用Bonferroni事后检验。
图5。
图5。
LINGO-1通过细胞间相互作用抑制OPC分化。汇合的星形细胞培养物在2 m.o.i.感染对照、FL-LINGO-1和ECTO-LINGO-1慢病毒。3天后在体外将新分离的OPC接种在感染的星形胶质细胞上，4天后通过MBP和O4免疫细胞化学检测少突胶质细胞分化。A类、MBP+细胞计数显示，暴露于表达LINGO-1的星形胶质细胞可降低OPC分化。FL-LINGO-1或ECTO-LINGO-2的作用相似。数值代表三种重复培养物/条件的平均值±S.E.。***，对<0.001单因素方差分析，采用Bonferroni事后检验。B类与受感染的星形胶质细胞共培养的OPC的代表性图像以及MBP和O4的双重染色显示，暴露于受LINGO-1感染的星形细胞可抑制MBP的表达(顶部面板,红细胞)O4的表达没有明显变化(中央面板,灰度). IRES下游eGFP荧光报告子的表达证实慢病毒感染成功（见“实验程序”和补充图4).
图6。
图6。
可溶性LINGO-1外结构域以反式形式与自身结合。 A类，稳定表达FL-LINGO-1的CHO细胞和对照细胞与增加剂量的可溶性LINGO-1胞外域一起孵育，并通过碱性磷酸酶活性测量结合蛋白，如“实验程序”所述(实线)通过从稳定转染FL-LINGO-1的CHO细胞获得的信号中减去对照CHO细胞得到的信号来计算(虚线). 与对照CHO细胞相比，可溶性LINGO-1外结构域与稳定转染FL-LINGO-1的CHO细胞表现出特异性、可饱和的结合。每个点代表四个重复井的平均值±S.E。用三批纯化的重组sLINGO-1蛋白分别进行至少八次结合实验。B类，新生大鼠OPC暴露于剂量增加的可溶性LINGO-1胞外区，冲洗并处理以进行Western blotting。典型的Western blot分析显示，结合外源性LINGO-1外结构域被检测到具有针对Fc标签的抗体。这个图表下面表示归一化为GAPDH的可溶性LINGO-1条带的密度定量。使用GraphPad Prism通过非线性回归拟合曲线。C类，sLINGO-1-Fc与未标记sLINGO-1的竞争性结合置换。如上所述，用50μg/ml标记的可溶性LINGO-1-Fc和可变浓度的未标记可溶性LINGO-1培养CHO细胞的OPC。半最大结合抑制值为～1μ米使用GraphPad Prism，通过具有竞争性约束的非线性回归、单站点logIC50模型确定。每个点代表三个重复井的平均值±S.E。
图7。
图7。
LINGO-1激活trans中的RhoA。在PDGF/FGF中生长3天的OPCs暴露于5 ng/ml LPA、100μg/ml可溶性LINGO-1胞外域或Fc对照，时间如图所示（见“实验程序”）。可溶性LINGO-1和LPA激活RhoA，通过GTP-结合RhoA的免疫沉淀进行评估，然后用总RhoA抗体对免疫沉淀和全细胞裂解物进行免疫印迹。这个图表下面显示了RhoA带的密度定量。数值表示15分钟时RhoA-GTP/总RhoA相对于Control-Fc的百分比水平。
图8。
图8。
LINGO-1抑制髓鞘形成的模型。LINGO-1，由轴突和NG2表达+OPCs在反式中与自身结合，以防止少突胶质细胞分化和轴突-胶质细胞相互作用期间的髓鞘形成(左边). O4+/MBP-髓鞘前少突胶质细胞LINGO-1蛋白的发育减少(中心)，也可能在轴突中，导致允许髓鞘形成的条件(上箭头路径). LINGO-1的持续表达维持了反式体内的自我作用，导致O4+/MBP−少突胶质细胞成熟至MBP+期和髓鞘化的能力降低(下箭头路径). 神经元，红色; OPC/少突胶质细胞，绿色; LINGO-1，蓝色线条指出了本研究中使用的阶段特异性少突胶质细胞标记物。灰色对象代表由同一少突胶质细胞髓鞘化的额外轴突，其髓鞘化节间起源于其他少突细胞（未图示）。
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