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.2012年5月25日；287(22):18142-52.
doi:10.1074/jbc。M112.344796。 Epub 2012年4月9日。

血清甘氨酸蛋白聚糖促进肥大细胞凋亡与坏死细胞死亡

法比奥·R·梅洛 1, 米尔贾纳·格鲁季奇, 简·斯皮科尔斯基, 加布里埃拉·卡卢诺娃, 冈纳·佩伊勒
附属公司

血清甘氨酸蛋白聚糖促进肥大细胞凋亡与坏死细胞死亡

法比奥·R·梅洛等。 生物化学杂志. .

摘要

控制细胞是否因凋亡或坏死而死亡的机制尚不完全清楚。在这里，我们发现血清甘氨酸，一种造血细胞的分泌颗粒蛋白聚糖，可以对这一决定产生重大影响。野生型和serglycin（-/-）肥大细胞对一系列细胞死亡诱导方案同样敏感。然而，野生型肥大细胞发生凋亡性细胞死亡，serglycin（-/-）细胞主要死于坏死。对潜在机制的研究表明，细胞死亡伴随着分泌颗粒化合物泄漏到胞质溶胶中，血清甘氨酸（-/-）肥大细胞的坏死表型与聚ADP核糖聚合酶-1的降解缺陷有关。缺少鼠肥大细胞蛋白酶6（一种主要的serglycin相关蛋白酶）的细胞在凋亡方面表现出与serglycin-/-细胞相似的缺陷，表明serglycin.的促凋亡功能是由于与Serglicin复合的蛋白酶的下游作用。综上所述，这些发现暗示了serglycin在促进凋亡与坏死细胞死亡方面的作用。

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数字

图1。
图1。
肥大细胞对TNF不敏感，但对CHX诱导的细胞死亡高度敏感。 A类、WT骨髓源性肥大细胞（BMMC）（0.5×106细胞/ml）未经处理或用TNF（10 ng/ml）和不同浓度的CHX处理24 h。使用基于resazurin的细胞活力测定法测量细胞活力。B类和C类，WT BMMC（0.5×106细胞/ml）未经处理或用10 ng/ml TNF和/或5μg/ml CHX处理。在指定的时间点收集细胞，并使用流式细胞仪通过AnnV和PI染色测量细胞死亡。数据为三倍±标准偏差的平均值(B类)活细胞百分比（AnnV−/PI公司−); (C类)死亡细胞百分比，凋亡（AnnV+/PI公司−)加上坏死（AnnV+/PI公司+)单元格。
图2。
图2。
血清甘氨酸促进肥大细胞凋亡而非坏死。 A类、WT和serglycin−/−BMMC（0.5×106细胞/ml）未经处理或用CHX（5μg/ml）处理。在指定的时间点收集细胞，并使用流式细胞仪通过AnnV/PI染色测量细胞死亡。数据为三倍±标准偏差的平均值。B类代表性样品的点图显示AnnV（FL-1）和PI（FL-3）染色。C类，DNA降解反应CHX。从WT和serglycin中提取DNA−/−在添加CHX（5μg/ml）后的指定时间点的BMMC，然后进行琼脂糖凝胶电泳。
图3。
图3。
CHX诱导BMMC细胞死亡的形态学效应。 A、，WT和serglycin−/−BMMC（0.5×106细胞/ml）未经处理或用CHX（5μg/ml）处理。在指定的时间点，制备胞浆载玻片，并用钙黄绿素-AM（活细胞探针，绿色)和乙炔同二聚体-1（EthD-1）（死亡细胞探针，红色). 通过荧光显微镜（原始放大倍数×20）进行分析。B类未处理WT和serglycin的透射电镜分析−/−BMMC公司(上部面板)显示出致密的岩芯地层(黑色箭头在插图中，WT），散布着电子半透明区域(红箭嵌入；WT），而serglycin颗粒含量−/−细胞外观无定形，无致密核形成。这个下部面板显示非活性WT和serglycin的典型形态−/−细胞。注意WT细胞中广泛的DNA凝集(箭头). 还要注意广泛的坏死迹象，即serglycin中的分解细胞膜−/−细胞。原始放大倍数，×12500。
图4。
图4。
蛋白酶抑制剂对WT和serglycin细胞死亡的影响−/−肥大细胞。WT和serglycin−/−骨髓源性肥大细胞（BMMC）（0.5×106细胞/ml）未经处理或用20μ米Z-DEVD-FMK，20μ米细胞渗透性caspase-9抑制剂，20μ米E-64d，1μ米钙肽，0.1米米Pefabloc SC或50μ米胃蛋白酶抑制素A，然后按指示培养48 h±5μg/ml CHX。细胞经AnnV和PI染色，流式细胞仪分析。数据为三等分±S.E.的平均值打开的零件条代表凋亡（AnnV+/圆周率−)单元格，以及填充的零件对应于坏死（AnnV+/PI公司+)单元格。
图5。
图5。
血清甘氨酸在顺铂、氧化应激和Fas结扎反应中促进细胞凋亡而非坏死。 A类、WT和serglycin−/−骨髓源性肥大细胞（BMMC）（0.5×106细胞/ml）用20μg/ml顺铂或0.75m米H（H）2O（运行）2在指定的时间点，用Annexin V（AnnV）/PI对细胞进行染色，并用流式细胞仪进行分析。数据为三倍±标准偏差的平均值。B类和C类、WT和serglycin−/−BMMC维持11个月(B类)或腹膜细胞源性肥大细胞（PCMC）(C类) (0.5 × 106用1μg/ml激动性CD95抗体或同型对照±5 ng/ml放线菌素D处理细胞/ml）。在指定的时间点，用AnnV/PI对细胞进行染色。数据为三倍±标准偏差的平均值。
图6。
图6。
PARP-1保存在serglycin中−/−细胞。WT和serglycin−/−BMMC（0.5×106细胞/ml）未经处理或用CHX（5μg/ml）处理(A类)或1μg/ml CD95抗体与5 ng/ml放线菌素D结合(B类). 在指定的时间点，对应于相同数量细胞的样本进行PARP-1（caspase-activated DNase抑制剂）的Western blot分析(ICAD公司)、凋亡诱导因子（AIF）、Rho-相关线圈蛋白激酶1(岩石-1)以β-actin为负荷控制。C类，PARP-1抑制逆转serglycin的坏死−/−BMMC。WT和丝氨酸甘氨酸−/−BMMC（0.5×106细胞/ml）未经处理或用5 m米3-氨基苯甲酰胺（3-AB），然后用5μg/ml CHX孵育。培养48小时后，用Annexin V（AnnV）/PI对细胞进行染色。D类，北美+未经治疗和CHX治疗（24小时）WT和serglycin的水平−/−BMMC。数据是三次处理的平均值±S.E。E类未经治疗和CHX治疗的WT和serglycin中的ATP水平−/−BMMC。数据为平均值±S.E(n个= 4).
图7。
图7。
分泌颗粒通透性伴随肥大细胞死亡。WT和serglycin−/−BMMC（0.5×106细胞/ml）未经处理或用CHX（5μg/ml）处理。A类在指定的时间点，收集细胞，制备细胞溶质提取物，并对小鼠肥大细胞蛋白酶6（mMCP-6）进行Western blot分析。B类用吖啶橙（AO；上部面板). 相应的细胞活力如下部面板数据为三倍±S.E.的平均值。
图8。
图8。
serglycin依赖性类胰蛋白酶小鼠肥大细胞蛋白酶（mMCP）6在调节BMMC凋亡中的作用。 A类、重量、mMCP-4−/−或mMCP-6−/−BMMC（0.5×106细胞/ml）未经处理或用CHX（5μg/ml）处理。在指定的时间点，收集细胞并用AnnV/PI染色。数据为三倍±标准偏差的平均值。B类代表性样品的点图显示AnnV（FL-1）和PI（FL-3）染色。C类细胞死亡期间DNA降解。从WT、mMCP-4中提取DNA−/−和mMCP-6−/−在添加CHX（5μg/ml）后的指定时间点的BMMC，然后进行琼脂糖凝胶电泳。D类、WT、serglycin−/−，mMCP-4−/−和mMCP-6−/−BMMC（0.5×106细胞/ml）未经处理或用CHX（5μg/ml）处理。在指定的时间点，对应于相同数量细胞的样本进行PARP-1的Western blot分析，以β-actin作为负荷对照。
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