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.2012年6月;22(6):954-72.
doi:10.1038/cr.2012.40。 Epub 2012年3月20日。

层粘连蛋白/β1整合素信号通过促进微管组装和稳定触发轴突形成

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层粘连蛋白/β1整合素信号通过促进微管组装和稳定触发轴突形成

文梁雷等。 单元格Res. 2012年6月.

摘要

神经元极化期间的轴突规范与非极化神经元的其中一个轴突中微管稳定性的增加密切相关,但微管稳定性增加是如何实现的尚不清楚。在这里,我们表明细胞外基质(ECM)成分层粘连蛋白通过β1整合素(Itgb1)调节定向微管组装促进神经元极化。在培养的海马神经元和皮层薄片中,与涂敷在培养基质或聚苯乙烯珠上的层粘连蛋白接触足以使未分化的轴突规范化。发现活性Itgb1集中在层粘连蛋白接触的神经突中。轴突形成分别通过增强和减弱Itgb1信号而促进和消除。有趣的是,层粘连蛋白接触以一种需要Itgb1的方式促进了plus-end微管组装。此外,稳定微管部分地防止了Itgb1下调引起的极化缺陷。最后,端脑背侧祖细胞中Itgb1的基因消融导致皮质锥体神经元轴突发育缺陷。因此,层粘连蛋白/Itgb1信号通路通过调节微管组装在体内外对轴突的启动和生长起着指导作用。本研究建立了神经元极化过程中外源性因子和内在细胞骨架动力学之间的联系。

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图1
图1
层粘连蛋白诱导的轴突起始需要Itgb1。(A)用pSUPER载体或pSUPER编码针对Itgb1的siRNA(#1、2、3或4)或扰乱序列转染HEK293细胞或培养的大鼠皮层神经元。以β-肌动蛋白为负荷对照,用免疫印迹法(IB)分析Itgb1蛋白水平。注意,#2和3在大鼠原代神经元和HEK293细胞中有效下调Itgb1,而#4在HEK293细胞中对Itgb1没有影响。因此,人类Itgb1(h-Itgbl)被用于以下救援实验。(B)将分离的海马神经元转染pSUPER载体或pSUPER-编码Itgb1 siRNA或打乱序列或Itgb1-siRNA加人Itgb1-表达结构。转染神经元用EGFP标记,轴突标记物Smi-312染色。细胞在层粘连蛋白基质上培养。比例尺,20μm。(C)神经元极性的量化。转染神经元分为三类:具有长度相似但无轴突(NA)的短突起的神经元,具有Smi-312阳性突起的神经细胞,以及超过100μm且至少是第二长突起(SA)的两倍长的神经元,以及具有两个或多个Smi-312阳性突起且>100μm且长度为其他轴突(MA)两倍的神经元。数据以六个实验中300个神经元的平均值±SEM表示。**P(P)< 0.01.(D),E)用Itgb1连接抗体9EG7或载体对照物处理DIV1的海马神经元48小时。神经元极性(D)和轴突长度(E)进行了定量分析。数据显示为三个实验中150个神经元的平均值±SEM。对照组轴突长度标准化为1.0。**P(P)< 0.01,***P(P)< 0.001.(F)将转染EGFP的海马神经元培养在层粘连蛋白条涂层的基底上。12小时后,用HUTS4抗体对培养物进行染色,以标记活性Itgb1。层粘连条纹由Alexa647-共轭BSA信号标记。(G)HUTS4对抗EGFP的强度在条上和条外神经突起中进行量化,条外平均值标准化为1。*P(P)< 0.05.(H)用编码Itgb1 siRNA或干扰序列(Ctrl)的pSUPER构建物转染海马神经元,并在层粘连蛋白条带(蓝色)和PDL涂层的基底上培养。48小时后,用Smi-312抗体对培养物进行染色。在涂层过程中,通过混合在层粘连蛋白溶液中的BSA-Alexa647观察层粘连蛋白质条纹。比例尺,20μm。(一)对偏好指数(PI,定义为[(条纹上的%)−(条纹下的%)]/100%)进行分析,以反映轴突起始位点对不同底物的偏好,无论是否存在Itgb1下调(有关分析的详细信息,请参阅补充信息,图S4)。
图2
图2
纹状层粘连蛋白以Itgb1依赖的方式决定轴突的定向生长。(A-D)用pSUPER质粒转染分离的皮层神经元(A)或编码Itgb1 siRNA或加扰序列的质粒(B)将其置于P0大鼠冠状皮质切片上。在某些情况下,预处理切片时不使用或使用外源性层粘连蛋白(100μg/ml),以干扰内源性层粘着蛋白模式(A)培养48小时后,追踪重叠神经元的形态(一个B类,右面板)和轴突延伸方向进行了分析(C),D).轴突起始的角度(C)或转弯(D)变化范围为+90°~−90°,正值或负值,表明轴突分别向皮层切片的心室侧或软脑膜侧启动或转向。显示的数据是所有采样的单个轴突神经元的轴突起始角和轴突转向角分布的累积百分比图(C),D)数据采用Kolmogorov-Smirnov检验进行分析(P(P)<0.001,对照组vs Itgb1 siRNA;P(P)<0.001,对照组vs外源性层粘连蛋白;n个=所有实验组40)。比例尺,20μm。(E)扩散印刷法产生的表面结合层粘连蛋白梯度(详见材料和方法)。通过免疫染色确定层粘连蛋白梯度,绘制荧光强度剖面图。(F-H)用编码控制混乱序列或Itgb1 siRNA的pSUPER质粒转染分离的海马神经元,并将其置于IgG或层粘连蛋白梯度上。48小时后,用Smi-312抗体对神经元进行染色(F)绘制了所有取样的单轴突神经元的轴突起始和转向角的累计百分比(G,H)。正值(0°至90°)或负值(−90°至0°)的角度表示轴突分别向梯度的高密度侧和低密度侧启动或转向。使用Kolmogorov-Smirnov检验分析数据(P(P)<0.001,IgG梯度vs层粘连蛋白梯度;P(P)<0.001,层粘连蛋白上的Ctrl-siRNA vs层粘连蛋白质上的Itgb1 siRNA;n个=所有实验组40)。
图3
图3
在薄片培养环境中,定向轴突的启动是由层粘连蛋白/Itgb1信号转导的。(A-D)E15.5小鼠子宫内用pCAG-IRES-GFP质粒与载体质粒或编码Cre的质粒进行电穿孔。将电穿孔小鼠的脑片植入层粘连蛋白或IgG涂层珠(用假黄色表示)。通过DAPI标记显示细胞层。所示为不同治疗组的示例图像。(E)定量分析与轴突样过程相关的珠子百分比。数据以三个独立实验的平均值±SEM表示。每次实验中,每个样品至少分析538个珠子。*P(P)< 0.05.(F),G)轴突样突起百分比的定量分析(F)或珠状突起的平均长度(G)。每个实验组至少分析216个神经突起。**P(P)< 0.01,***P(P)<0.001,N.S.,无显著差异。比例尺,10μm。
图4
图4
Itgb1的缺失影响LKB1/SAD激酶途径。(A)对具有指定基因型的同窝出生的P0小鼠的海马或皮层的匀浆进行具有指定抗体的IB。(B)将分离的皮层神经元转染pSUPER质粒或编码Itgb1#4 siRNA或#4 siRNA的质粒加上siRNA-resistant h-Itgb1,然后将其置于层粘连蛋白底物上。对细胞裂解物进行具有指示抗体的IB。所示斑点是三个独立实验的代表。(C)用编码乱序序列或Itgb1 siRNA或Itgb 1 siRNA加SAD A/B激酶表达结构的质粒转染分离的海马神经元,并将其固定在层粘连蛋白底物上。在DIV3分析神经元极性。所示为至少三个独立实验的平均值±SEM(n个=所有实验组120)。*P(P)< 0.05.
图5
图5
Itgb1对于层粘连蛋白诱导的微管在神经元极化过程中的稳定和组装至关重要。(A)将分离的海马神经元转染指定的质粒组合(打乱的siRNA、Itgb1 siRNA或Itgb1-siRNA加上h-Itgb1),并在涂有层粘连蛋白条(蓝色)的底物上培养。DIV2转染神经元用乙酰化(乙酰,绿色)和酪氨酸化(酪氨酸,红色)-α-微管蛋白抗体染色。比例尺,10μm。(B)定量-上(箭头所示)或外条(箭头所指)的轴突的乙酰与酪氨酸-管蛋白(A/T)之比,条上对照轴突的值标准化为1.0。数据显示为三个实验的平均值±SEM。每组至少分析30个神经突起。***P(P)<0.001,学生-测试。(C)将EGFP-EB3转染海马神经元,并将编码干扰siRNA或Itgb1 siRNA的质粒培养在层粘连蛋白条带覆盖的基底上。比例尺,10μm。在DIV2,使用活体成像荧光显微镜记录单个EGFP-EB3点的运动。图中所示为无或有Itgb1下调的神经元中条带内(c1,c3)或条外(c2,c4)轴突的典型波形图。(D)在没有或有Itgb1下调的神经元中,顺向、逆行或不动的EGFP-EB3彗星在层粘连蛋白条上或层粘连条外的轴突中所占的百分比。*P(P)<0.05,**P(P)<0.01与对照组,与学生的方差分析-测试。(E)所示各组EB3穿孔速度的量化。*P(P)<0.05 vs条带控制。
图6
图6
紫杉醇稳定微管可以部分防止Itgb1下调引起的神经元极性丢失。(A)用编码扰码或Itgb1 siRNA的pSUPER质粒转染海马神经元,然后用细胞松弛素D(1μM)、latrunculin A(1μM)或紫杉醇(2 nM)在DIV1处理12 h。显示了不同组EGFP阳性神经元的代表性重建图像。比例尺,10μm。(B)神经元极性的量化。注意,细胞松弛素D、latrunculin A或紫杉醇治疗均增加了MA神经元的百分比(***P(P)<0.001 vs对照组)。紫杉醇治疗显著增加Itgb1 siRNA转染神经元中SA和MA阳性神经元的百分比(**P(P)< 0.01,*P(P)<0.05,Itgb1 siRNA vs Itgb1-siRNA加紫杉醇)。
图7
图7
Itgb1在轴突发育中的重要作用体内.(A)DiI晶体被放置在控制的体感皮层(Itgb1号机组飞行/飞行)或突变小鼠(Itgb1号机组飞行/飞行;Emx1-核心Itgb1号机组(f)/+;Emx1-核心)第3页。冠状面显示向胼胝体(箭头)或内囊(箭头)的下降束。通过DAPI标记显示细胞层。放大后的图像(10倍)分别显示了内侧(a1和a3)和外侧(a2和a4)投射中的轴突纤维。(B)控制的皮层部分(Itgb1号机组飞行/飞行)和Itgb1突变体(Itgb1号机组飞行/飞行;Emx1-核心)P0小鼠用TAG1抗体染色。底部的放大图像(5倍)分别显示胼胝体(比较b1和b3)和内囊(比较b2和b4)中的轴突纤维。比例尺,2毫米和50微米(插入)英寸一个,1毫米和100微米(插入)英寸B类.
图8
图8
Itgb1在轴突起始中的细胞自主作用体内.(A) Itgb1号机组飞行/飞行Itgb1号机组(f)/+E15.5小鼠子宫内用pCAG-IRES-GFP质粒与载体质粒或编码Cre的质粒进行电穿孔。P3小鼠的皮层切片用放射状胶质细胞标记物RC2抗体染色,细胞层用DAPI标记。右车道图像显示单细胞形态。(B)带有细长下降轴突的皮质板中极化神经元百分比的量化(n个=所有组80)。比例尺,100μm(左四车道)或10μm(右车道)。*P(P)< 0.05.

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