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.2012年6月15日;21(12):2779-92.
doi:10.1093/hmg/dds106。 Epub 2012年3月15日。

DISC1变异体37W和607F破坏其在ATF4介导的转录中的核靶向和调节作用

附属公司

DISC1变异体37W和607F破坏其在ATF4介导的转录中的核靶向和调节作用

Elise L V马拉瓦西等。 人类分子遗传学. .

摘要

精神分裂症1型(DISC1)是精神疾病的一个强有力的候选基因,它编码一个多室分子支架,调节在神经发育和可塑性中起关键作用的相互作用蛋白。错觉DISC1变异体与健康携带者的精神疾病风险和大脑异常相关,但其潜在机制尚不清楚。我们研究了罕见和常见的DISC1氨基酸替代对亚细胞靶向性的影响。我们报道,罕见的推定因果变体37W和常见变体607F都以显性负向的方式独立破坏DISC1核靶向,预测DISC1核表达在37W和607F载体中受损。在细胞核中,DISC1与转录因子激活转录因子4(ATF4)相互作用,ATF4参与调节细胞应激反应、情绪行为和记忆巩固。在基础cAMP水平上,野生型DISC1抑制ATF4的转录活性,这种作用被37W和607F单独削弱,很可能是因为它们的核靶向缺陷。共同变体607F还减少了DISC1/ATF4相互作用,这可能是其抑制作用减弱的原因。我们还证明,DISC1调节内质网应激的转录反应,并且这种调节作用被37W和607F阻断。通过显示与精神疾病相关的DISC1氨基酸替换影响其在ATF4介导的转录中的调节功能,我们的研究强调了这些变体可能影响介导认知、情绪反应和应激反应的转录事件的潜在机制,与精神疾病直接相关的所有过程。

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数字

图1。
图1。
DISC1变体对其亚细胞分布的影响。(A类)转染COS7细胞细胞核中DISC1变体的相对丰度计算为细胞核DISC1染色的总像素强度与整个细胞DISC1染色总像素强度之间的比值。条形图表示三个独立实验中测得的平均值,其中分析了50个细胞/变体。(B类)表达野生型DISC1、DISC1-37W或DISC1-607F的COS7细胞的典型共焦图像。DISC1呈绿色,细胞核用DAPI(蓝色)染色。比例尺为20μm。(C类)野生型DISC1、DISC1-37W或DISC1-607F在从转染SH-SY5Y细胞制备的全细胞裂解物和可溶性核提取物(SNE)中的分布。每个条形代表四个独立实验的平均值。(D类)从未转染(底部)或转染野生型DISC1(顶部)的SH-SY5Y细胞中获得的等量亚细胞蛋白提取物分别通过免疫印迹法分析,以检测内源性或外源性DISC1。ME,膜提取物;CE,细胞质提取物;CSKE,细胞骨架提取物;CBNE,染色质结合核提取物*非特定波段。(E类)从转染野生型、37W或607F DISC1的SH-SY5Y细胞中获得所示的亚细胞蛋白提取物,并通过western blotting检测外源性DISC1,然后进行带密度测定。负载控制是已知优先富集在所分析的不同亚细胞组分中的蛋白质。条形图表示四个独立实验的平均值。所有密度测定数据均归一化为野生型DISC1的相对带强度。显示了蛋白质标记的位置和大小(kDa)。
图2。
图2。
37W和607F DISC1的主要负效应。(A类)用Flag-WT DISC1和等量的Myc-DISC1-WT、Myc-DISC1 37W或Myc-DISS1-607F转染SH-SY5Y细胞。然后通过蛋白质印迹在从转染细胞制备的全细胞裂解物和核提取物(NE)中定量Flag WT DISC1的相对丰度。条形图表示三个独立实验的平均值。将数据归一化为仅表达WT DISC1的样本中Flag-DISC1的相对带密度。(B类)Flag-DISC1(绿色)和Myc-DISC1(红色)在表达Flag-WT DISC1的代表性COS7细胞中的亚细胞分布,以及等量的Myc-DISC1-WT(顶部)、Myc-DDSC1-607F(中部)或Myc-DDCS1-37W(底部)。细胞核的放大图显示在远右面板上**P(P)< 0.01;#双尾配对学生t吨-测试。比例尺为20μm。
图3。
图3。
DISC1变异体对ATF4介导的转录的差异效应。(A类)转染固定量pCG-ATF4和减少野生型DISC1数量的HEK293细胞中CRE依赖性荧光素酶的相对活性。数字表示用于转染的质粒DNA的数量(ng/well)。(B类C类)仅转染ATF4或与所示DISC1变体联合转染的HEK293(B)或人类少突胶质细胞MO3.13细胞(C)中CRE驱动的荧光素酶相对活性。(D类)仅转染ATF4或与所示DISC1变体联合转染的HEK293细胞中CHOP AARE驱动的荧光素酶相对活性。所有数据均归一化为仅用报告者转染的细胞(CRE或AARE)中的相对荧光素酶活性。条形图表示至少三个独立实验的平均值*P(P)< 0.05, **P(P)< 0.01.
图4。
图4。
DISC1 LZ9对DISC1核分布和ATF4转录调控的影响。(A类)表达DISC1ΔLZ9(绿色)的代表性COS7细胞的共焦图像。细胞核用DAPI染色(蓝色)。(B类)仅转染报告基因(CRE)或与ATF4联合转染的HEK293细胞中的相对荧光素酶活性,无论有无野生型DISC1或DISC1ΔLZ9。条形图表示四个独立实验的平均值。将数据归一化为仅表达报告者(CRE)的细胞中的相对荧光素酶活性*P(P)<0.05,双尾配对学生t吨-测试。比例尺为20μm。
图5。
图5。
DISC1对CRE介导的thapsigargin转录反应的影响。HEK293细胞仅转染报告基因(CRE)或与指定的表达结构联合转染。从转染后32小时开始,在检测荧光素酶活性之前,将细胞暴露于thapsigargin或载体(DMSO)中指定的时间。条形图表示至少三个独立实验的平均值**P(P)< 0.01.
图6。
图6。
DISC1不影响ATF4的核靶向和蛋白质水平。(A类)仅用ATF4转染的代表性COS7细胞(顶部面板)或与DISC1联合转染的细胞(下部面板)。由白色矩形分隔的区域在插图中放大。(B类)单独或与DISC1联合转染ATF4的HEK293细胞制备的全细胞裂解物或核提取物中的ATF4蛋白水平。这些实验中使用的ATF4/DISC1 DNA比率与荧光素酶报告分析中使用的比率相同。负载控制为全细胞裂解物的组蛋白3(H3)和核提取物的核基质蛋白p84。条形图表示三个独立实验的平均值。比例尺为20μm。显示了蛋白质标记的位置和大小(kDa)。
图7。
图7。
DISC1变体对DISC1和ATF4之间相互作用的影响。(A类)用pCG-ATF4单独或与指定的DISC1变体联合转染HEK293细胞。使用抗Flag抗体免疫沉淀外源性DISC1,并使用抗DISC1抗体(α-DISC1)进行检测。用抗ATF4抗体(sc-200)检测到共沉淀ATF4。条形图表示三个独立实验的平均值*非特定波段。指示了蛋白质标记物的位置和大小(kDa)。(B类)转染DISC1(绿色)和ATF4(红色)所示变体的COS7细胞。右侧面板表示相应的合并图像。由白色方块分隔的区域在插图中放大。比例尺为20μm。

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引用人

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