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.2012年5月4日；287(19):15284-97.
doi:10.1074/jbc。M111.314062。 Epub 2012年3月6日。

线粒体靶向细胞色素CYP2E1的加性效应和酒精毒性对细胞色素c氧化酶功能和呼吸小体复合物稳定性的影响

Seema Bansal公司 1, 萨蒂什·斯里尼瓦桑, 苏雷什库马尔·阿南达达戈潘, 安妮迪亚·罗伊·乔杜里, 文卡特斯·塞瓦拉吉, 巴拉拉曼·卡利亚纳拉曼, 乔伊·约瑟夫, 纳拉扬·G·阿瓦达尼
附属公司

线粒体靶向细胞色素CYP2E1的加性效应和酒精毒性对细胞色素c氧化酶功能和呼吸小体复合物稳定性的影响

Seema Bansal公司等。 生物化学杂志. .

摘要

酒精处理通过增加部分还原的氧的产生和减少包括谷胱甘肽在内的细胞抗氧化剂库来诱导氧化应激。最近，我们发现线粒体靶向的CYP2E1增强了酒精介导的毒性，导致活性氧生成和氧化应激增加。这里，我们表明线粒体呼吸链的末端氧化酶细胞色素c氧化酶（CcO）是CYP2E1介导的酒精毒性的关键靶点。主要表达线粒体靶向（Mt（++））CYP2E1的COS-7和Hep G2细胞系和酒精治疗大鼠的肝脏显示出CcO活性下降和蛋白质羰基化增加，同时伴有CcO复合体亚基I、IVI1和Vb的稳态水平下降。与野生型（WT）CYP2E1表达或ER（+）细胞（主要是微粒体靶向细胞）相比，Mt（++）细胞中的这些变化更为显著。此外，线粒体特异性抗氧化剂、与三苯基鏻偶联的泛喹啉、与三苯膦偶联的羧基脯氨酸和CYP2E1抑制剂二烯丙基硫阻止了CcO活性和CcO亚基的损失，很可能是通过减少对酶复合物的氧化损伤来实现的。我们的结果表明，CcO的损伤和呼吸小体复合体的分离是酒精诱导毒性的关键因素，线粒体靶向的CYP2E1可增强这种毒性。我们认为，CcO是酒精诱导毒性导致呼吸功能障碍的直接直接靶点之一。

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数字

图1。
图1。
酒精介导的稳定细胞表达CYP2E1的呼吸抑制。使用Seahorse Bioscience XF24细胞外通量分析仪测量OCR。对照细胞和经酒精处理的细胞（各20000个）培养16小时，然后在分析前用XF培养基（低缓冲无碳酸氢盐，pH 7.4）改变1小时。培养皿中没有CO2记录呼吸频率前一小时。A、，%添加或不添加100 m的整个细胞中的OCR米酒精48h；B、，%经25m和不经25m处理的细胞中的OCR米酒精48小时。平均值和S.E.由三个单独的分析测定。*代表对≤0.05且**代表对≤ 0.001.
图2。
图2。
线粒体和微粒体靶向的CYP2E1对细胞色素的影响c（c）氧化酶活性。通过将15μg来自对照细胞和乙醇处理细胞的冻融线粒体提取物培养在1ml分析培养基（25mm）中来测量CcO活性米磷酸钾，pH 7.4，0.45 m米十二烷基麦芽糖苷和15μ米还原细胞色素c（c）). 在550 nm处，由于细胞色素的作用，吸收率降低，随后测量CcO活性c（c）氧化。A、，通过服用2.8μmol细胞色素计算相对活性c（c）氧化/分钟每毫克蛋白质为100%(B类).B、，CYP2E1抑制剂DAS、NAC和线粒体抗氧化剂（Mito-CP和Mito-Q）在零时间加入或不加入酒精并孵育48小时的影响。基于对照细胞在交流，对照组和配对喂养大鼠肝线粒体的CcO活性。如图所示，酒精治疗持续2-10周。对照大鼠肝线粒体的活性（6.1μmol细胞色素c（c）每毫克蛋白质氧化/分钟）被认为是100%。数据以三个实验的±S.E.表示，并使用未配对的双尾Student’St吨测试。*代表对<0.05，**代表对< 0.001.
图3。
图3。
酒精处理对CcO IVI1和Vb亚单位水平的影响。 A类和B、，Mock，ER线粒体蛋白的免疫印迹分析+、重量、公吨+和Mt++用和不用乙醇处理的细胞系（100 m米48h）和来自对照组和酒精对饲大鼠肝脏的大鼠肝线粒体。蛋白质（每个50μg）在12%凝胶上通过SDS-PAGE进行解析，并使用抗CcO IVI1和抗CcOVb抗体进行免疫印迹分析。用线粒体特异性标记物琥珀酸脱氢酶（SDH）或孔蛋白的抗体作为负荷对照来检测印迹。C、，抗氧化剂Mito-Q（2μ米)和CYP2E1抑制剂DAS（10μ米)蛋白质的稳态水平。D、，取对照组和双饲酒精（各50μg）的大鼠肝线粒体进行负载。通过Li-Cor Odyssey红外成像系统对印迹进行成像，并使用体积分析软件对带密度进行量化。
图4。
图4。
酒精处理大鼠肝线粒体中血红素a/a3含量降低。用乙醇喂养6周的大鼠肝脏线粒体蛋白（900μg）溶解于2 ml 25 m米磷酸盐缓冲液，pH 7.4，含有2%十二烷基麦芽糖苷，每个1ml样品分布在两个试管中。在一个试管中加入二硫代物。在Cary E1双光束分光光度计中在400至650nm的范围内记录还原的负氧化样品的差异光谱。
图5。
图5。
酒精介导CYP2E1表达细胞和大鼠肝线粒体中含CcO-呼吸小体复合体的破坏。使用150μg溶解在0.8%十二烷基麦芽糖苷缓冲液中的线粒体蛋白在6–13%丙烯酰胺梯度凝胶上进行BNG电泳，如“实验程序”所述。A、，将BNG中的蛋白质转移到PVDF膜上，并用ATP酶β亚单位抗体进行检测(上部面板)和CcO IVI1亚单位抗体(下部面板). 这个条形图上正确的显示了根据“实验程序”中所述的斑点图像分析计算的相对带强度。结果是两个代表性斑点的平均值。B、，亚络合物和超络合物的二维蓝色天然SDS-PAGE分析。按照“实验程序”所述，从BNG电泳中切下条带，并在10%Tricine凝胶上进行二维解析。用CcO亚基IVI1抗体探测印迹，以观察复合物。这个条形图上正确的显示了WT和Mt络合物的相对带强度++用或不用酒精处理的细胞。根据三次单独运行计算平均±S.E.值。C、，10周对照大鼠肝线粒体的二维BNG(上部面板)和饮酒成对(下部面板). 这个条形图在底部显示了不同超络合物的相对带强度，如中所述A类和B类以及“实验程序”下的值C类是两次独立运行的平均值。
图6。
图6。
乙醇喂养大鼠和表达CYP2E1的细胞的电子转移复合物的蛋白质羰基化程度。溶解在含麦芽糖苷钠缓冲液中的线粒体蛋白质（各150μg）按照图5和“实验程序”进行BNG分析蛋白质被转印到PVDF膜上，并用2，4-二硝基苯肼衍生，通过检测DNP抗体检测侧链羰基化。A、，对照组和酒精喂养大鼠肝脏不同复合物的蛋白质羰基化水平。切除与所示复合物对应的条带，并用DNP结构域抗体进行探测。B、，WT、ER复合物+和Mt++通过BNG电泳解析表达CYP2E1的细胞，并在衍生化后用DNP抗体探测(上部面板). 将对应于来自相同运行伴印迹的复合物V的条带，用未经衍生的ATPaseβ抗体探测，用作负载控制(下部面板).
图7。
图7。
酒精处理对线粒体DNA和线粒体mRNA的影响。mtDNA水平用实时PCR测定Gapdh公司DNA作为参考。A、，对照双喂养和酒精喂养大鼠肝脏的线粒体DNA拷贝数。B类和C、，酒精对表达WT、ER细胞线粒体DNA含量的影响+和Mt++CYP2E1。D、，酒精处理对细胞核编码水平的影响CcoIVI1公司基因。E类和F、，酒精对CcoI公司和Atpase6酶不同细胞系的mRNA水平。DAS的影响（10μ米)线粒体抗氧化剂Mito-CP（2μ米)在Mt++显示单元格。数据表示三个独立实验的平均值±S.E.。*表示对<0.05，**表示对< 0.001.
图8。
图8。
稳定表达WT和Mt的Hep G2细胞中酒精介导的ROS产生和CcO活性的丧失++第2e1页。按照“实验程序”所述制备稳定表达CYP2E1 cDNA的Hep G2细胞A、，使用CYP2E1蛋白抗体对线粒体和微粒体部分（各50μg蛋白质）进行免疫印迹分析。该印迹也与NADPH细胞色素P450还原酶抗体共同开发(净现值)评估相对交叉污染。B、，用来自对照细胞和酒精处理细胞（300 m）的线粒体测定CcO活性米酒精96小时）。结果是三个独立实验的平均值±S.E。C、，使用亚单位特异性抗体进行免疫印迹分析，分析来自对照细胞和酒精处理细胞的线粒体蛋白（各50μg）的CcO亚单位IVI1和Vb水平。该印迹也与孔蛋白抗体和ATP酶β亚单位抗体共同开发，用作负荷对照。下面给出的CcO亚基IVI1和Vb的相对带强度分别代表了两个代表性序列的平均值。D、，%乙醇处理（300m）后测定每种细胞类型的细胞活力米96小时），如“实验程序”所述E、，细胞外H2O（运行）2按照“实验程序”中的描述，使用Amplex Red方法测量浓度。乙醇处理（300m米)持续96小时。Mito-CP（2μ米)在测量前12h添加。数据表示三个独立测量值的平均值±S.E.。*表示对<0.05和**表示对< 0.001.
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参考文献

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