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比较研究
.2012年2月29日；32(9):3176-92.
doi:10.1523/JNEUROSCI.6439-11.2012。

抑制NFAT通路减轻阿尔茨海默病小鼠模型中淀粉样β的神经毒性

埃洛伊斯·哈德里 1, 吴海燕, 米查尔·阿贝尔-奥尔纳, 桥本忠美, 罗兰·松下, 展云帆, Tara L Spires-Jones公司, 丽贝卡·贝滕斯基, 布莱恩·巴克斯卡, 布拉德利·T·海曼
附属公司
比较研究

抑制NFAT通路减轻阿尔茨海默病小鼠模型的淀粉样β神经毒性

埃洛伊斯·哈德里等。 神经科学. .

摘要

淀粉样β（Aβ）肽是与阿尔茨海默病（AD）相关的主要病理物质，它干扰细胞内钙稳态，进而激活钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶（CaN）。由Aβ诱导的CaN活化导致神经元的病理形态学改变，组成活性钙调神经磷酸酶的过度表达足以产生类似的表型，即使没有Aβ。在这里，我们测试了钙调神经磷酸酶通过激活活化T细胞的核转录因子（NFAT）介导神经退行性效应的假说。我们发现，Aβ暴露诱导的脊椎丢失和树突状分支简化均被组成性活性NFAT模拟，而当使用基因编码抑制剂VIVIT阻断NFAT激活时，这两种作用被取消。当VIVIT特异性作用于细胞核时，观察到了相同的有益作用，从而加强了NFAT转录活性在Aβ相关神经毒性中的作用。在体内，当VIVIT或其核对应物通过基因治疗方法在阿尔茨海默病转基因模型中过度表达时，淀粉样斑块附近观察到的脊椎丢失和神经炎异常被阻断。总的来说，这些结果表明NFAT/钙调神经磷酸酶转录级联有助于Aβ突触毒性，并可能为神经保护策略提供一组新的特定途径。

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图1。
图1。
VIVIT-GFP过度表达抵消组成性激活钙调神经磷酸酶的作用。A类，用WtCaN或CACaN以及GFP或VIVIT-GFP转染的皮层原代神经元中GFP、NFATc4免疫染色和DAPI（顶行）的代表性图片（转染的细胞由箭头指示）。在过度表达CACaN和GFP的细胞（第二行）中检测到NFATc4免疫染色和DAPI的共同定位增加，当VIVIT-GFP联合感染时，这一现象被消除。底部一行表示使用ImageJ检测细胞核和细胞质中的NFATc4免疫染色。比例尺，50μm。B与GFP和WtCaN+GFP相比，CACaN过表达时，细胞核和细胞质之间的NFATc4比率显著增加。当CACaN与VIVIT-GFP联合转染时，细胞核/细胞质比率显著降低，与WtCaN+GFP转染的神经元相当。C类，使用荧光素酶报告系统对NFAT转录活性的分析表明，与WtCaN和CACaN+VIVIT相比，CACaN的过度表达导致荧光素酶信号显著升高（即NFAT转录活动更高）。D类,E类转染GFP、WtCaN/GFP、CACaN/GFP或CACaN/VIVIT-GFP的神经元的代表性图像和脊椎密度定量显示，与GFP或WtCaN+GFP过度表达神经元相比，联合转染CACaN和GFP的细胞脊椎密度降低，VIVIT-GFP显著增加。比例尺，100μm。F类CACaN也影响每种脊椎类型的比例，与GFP和WtCaN/GFP转染的神经元相比，观察到更成熟的“蘑菇”脊椎显著减少。当VIVIT-GFP过度表达时，这种效应被大大消除。G公司与CACaN/GFP转染细胞相比，VIVIT抑制剂与CACaN共表达时，树突状细胞的整体复杂性也得到改善。GFP、WtCaN/GFP和CACaN/VIVIT-GFP转染细胞之间未观察到统计差异*第页< 0.05, **第页<0.001和***第页< 10−5. (n个>每个条件40个电池）。
图2。
图2。
组成型激活的NFATc4的过度表达足以诱导初级神经元的异常形态变化。A类，用WtNFAT/CANFAT（慢病毒载体）转导的皮层神经元中核膜标记层粘连蛋白B1和HA标记NFATc4的代表性图像。WtNFAT（左）主要存在于细胞质中，位于由层粘连蛋白B1分隔的细胞核外。相反，NFATc4的组成激活形式集中在细胞核中，符合层粘连蛋白B1染色。CANFAT的核定位不受VIVIT-GFP过度表达的影响（右）。比例尺，10μm。B，用WtNFAT或CANFAT转导的GFP填充神经元（顶部）和树突（底部）的图像。比例尺，100μm。C类与WtNFAT转导细胞相比，CANFAT的过度表达与每个树突状片段的棘数目减少有关。VIVIT-GFP不能改善CANFAT表达神经元中树突状棘的丢失。D类与WtNFAT相比，CANFAT还降低了树突的整体复杂性。VIVIT-GFP无法挽救CANFAT诱导的较低树突复杂性(第页>与CANFAT/GFP转染细胞相比为0.18）*第页<0.05和**第页< 0.01. (n个>每个条件30个电池）。
图3。
图3。
VIVIT-GFP改善了Tg神经元和TgCM处理神经元的形态学异常。A类，Wt和Tg GFP标记神经元（左）和树突（右）的代表性图像，18 DIV比例尺，100μm。B与Wt同窝细胞相比，GFP转染的Tg神经元呈现较低的脊椎密度，但当Tg神经元先前转染VIVIT-GFP时，脊椎数量显著增加。C类此外，对Wt和Tg培养物的Sholl图分析显示，与Wt神经元相比，过表达GFP的Tg神经元的树突树状化的复杂性总体降低。VIVIT-GFP转染Tg神经元后，树突状突起的简化被完全纠正，达到Wt神经元观察到的复杂程度(第页=NS与转染GFP的Wt神经元相比）。D类，野生型皮质神经元（左）和树突（右）的代表性图像，表达GFP或VIVIT-GFP，用WtCM、TgCM或耗尽的TgCM治疗24小时后。比例尺，100μm。E类，树突棘定量表明，短时间暴露于低聚aβ会导致其密度显著降低，而当应用WtCM时，棘不受影响。然而，当TgCM处理的神经元过度表达VIVIT-GFP或之前使用6E10抗体从培养基中去除Aβ肽时，脊柱密度保持不变*第页< 0.01, **第页<0.0001和***第页< 10−10. (n个>每个条件40个电池）。
图4。
图4。
NLS-VIVIT-GFP定位仅限于细胞核，而Myr-VIVIT-GWP则不在此隔室中。A类，转染GFP、NLS-VIVIT-GFP或Myr-VIVIT-GFP，然后染色层粘连蛋白B1和DAPI的初级神经元的代表性图像（左）。右侧，高倍图像显示，在细胞核和细胞质中仅能检测到GFP，而NLS-VIVIT-GFP被层粘连蛋白B1包围，并与DAPI共定位，表明其仅限于细胞核。相反，Myr-VIVIT-GFP被排除在核隔间之外。比例尺，50μm。BGFP和Myr-VIVIT-GFP均可在树突轴和脊椎中检测到，正如与DsRed的共定位所示。然而，NLS-VIVIT-GFP在神经元过程中不存在。比例尺，100μm。
图5。
图5。
VIVIT在细胞核内的有限定位有效地抑制了由CaN过度激活形式引起的形态学异常。A类，使用pNFAT-luciferase报告系统评估NFAT转录活性表明，NLS-VIVIT-GFP和CACaN的过度表达与荧光素酶活性降低有关。当Myr VIVIT-GFP过表达时，没有观察到任何作用，这表明这种抑制剂不影响NFAT的转录活性。B共转染GFP、NLS-VIVIT-GFP和Myr-VIVIT-GFP以及CACaN和WtCaN的皮层初级神经元（顶部）和树突（底部）的代表性图像。为了能够在所有条件下观察神经突并量化树突棘，细胞与DsRed荧光报告基因共转染。比例尺，100μm。C类通过与靶向核VIVIT（NLS-VIVIT-GFP）联合转染，与组成性激活CaN（CACaN）过度表达相关的脊椎密度降低可以得到改善，而膜结合VIVIT没有观察到任何有益的影响。D类NLS-VIVIT的过度表达也会导致CACaN转染神经元更复杂的树突状树枝状结构，而Myr-VIVIT过度表达不能挽救CACaN的作用*第页< 0.05. (n个>每个条件30个电池）。
图6。
图6。
NLS-VIVIT-GFP可阻止Tg神经元和TgCM处理细胞中观察到的异常神经元形态，但Myr-VIVIT-GWP不能阻止。A类，DsRed填充的Wt或Tg神经元（左）和树突（右）过度表达GFP或不同VIVIT结构的代表性图像显示，与GFP转染的Tg细胞相比，NLS-VIVIT-GFP转导的Tg电池呈现增加的脊椎密度。比例尺，100μm。B，柱状图总结了各组的平均脊柱密度，证实只有核靶向肽能够改善Tg神经元中观察到的形态异常，但Myr-VIVIT-GFP过度表达的情况并非如此。C类Sholl的图分析表明，与GFP转染的Tg神经元相比，NLS-VIVIT-GFP也增加了树突复杂性，并达到Wt神经元中观察到的复杂性水平。D类、GFP、NLS-VIVIT-GFP或Myr-VIVIT-GFP联合转染后DsRed填充神经元（左）或树突状片段（右）的图像，以及WtCM和TgCM治疗24小时后的图像。比例尺，100μm。E类TgCM可诱导脊椎密度降低，NLS-VIVIT-GFP可抑制TgCM降低脊椎密度，但Myr-VIVIT-GWP不能抑制TgCM降低脊柱密度*第页< 0.05, **第页<0.001和***第页< 10−5. (n个>每个条件40个细胞）。
图7。
图7。
体内，NLS-VIVIT-GFP靶向细胞核，AAV-NLS-VIVI和AAV-Tdtomato的共注射有效地转导相同的细胞。A类，代表体内注射AAV-NLS-VIVIT-GFP的小鼠图像（左）证实NLS-VIVIT的定位仅限于细胞核，并与局部应用Hoechst的小鼠共定位（右）。比例尺：左侧100μm，右侧50μm。B，将AAV-NLS-VIVIT-GFP和AAV-Tdtomato以适当的比例（3:1）共射是一种能够检测脊椎的有效方法体内并确定观察到的番茄转导细胞也表达NLS-VIVIT（箭头表示GFP/Tdtomato双阳性细胞）。比例尺：顶部100μm，底部50μm。
图8。
图8。
VIVIT-GFP和NLS-VIVIT-GWP可显著改善淀粉样沉积附近检测到的脊椎丢失。A类，左侧，z（z）-在注射AAV-GFP或周围淀粉样蛋白沉积的APP/PS1小鼠中，代表GFP填充神经突起的双光子图像投影。图为使用Neuronstudio软件检测树突棘的示例。棕色、红色和黄色圆圈分别表示蘑菇状、短粗和薄刺。比例尺，50μm。B条形图总结了各组的平均脊椎密度，证实注射AAV-VIVIT-GFP和AAV-NLS-VIVIT-GFP的APP/PS1小鼠的脊椎密度高于注射AAV-GFP的Tg动物，其周围100μm范围内的淀粉样沉积物。VIVIT-GFP或NLS-VIVIT-GFP处理组的脊椎密度与GFP注射组的窝友没有显著差异。C类从注射GFP的APP/PS1小鼠收集的脊椎密度数据散点图显示，脊椎密度与淀粉样沉积的距离呈正相关，但当动物分别接受NLS-VIVIT-GFP或VIVIT-GWP治疗时，淀粉样斑块的这种局部效应部分甚至完全消失*第页AAV-GFP治疗的APP/PS1小鼠与AAV-VIVIT-GFP或AAV-NLS-VIVIT-GWP注射动物之间的差异<0.05。(n个=6只动物和n个<每种条件下分析的200个枝晶）。
图9。
图9。
VIVIT-GFP和NLS-VIVIT-GWP的过度表达可部分改善神经炎异常体内.代表性图片(A类)和量化(B)淀粉样蛋白沉积周围的营养不良表明，注射AAV-VIVIT-GFP时出现的神经炎性营养不良较少，但NLS-VIVIT-GFP过度表达时没有改善。比例尺，50μm。(n个<35个淀粉样斑块和n个每组分析的营养不良<250例）。C类，APP/PS1注射小鼠GFP和淀粉样沉积免疫染色的代表性图像。比例尺，100μm。D类在注射AAV-GFP的APP/PS1小鼠中，曲率比率的增加与每个突起到最近淀粉样沉积的距离呈负相关(第页<0.0001，斜率=-0.0006）。然而，在用VIVIT-GFP治疗的APP/PS1小鼠中没有这种相关性(第页=0.953，斜率=-5.12×10−6)或NLS-VIVIT-GFP(第页=0.812，斜率=0.00003）*第页< 0.05. (n个=每组6只动物）。
图10。
图10。
VIVIT-GFP和NLS-VIVIT-GWP的过度表达可阻止NFATc4在转导神经元的细胞核中积聚。A类GFP免疫染色和注射动物内源性NFATc4的代表性图像允许检测转导神经元中的内源性NFATc4。比例尺，50μm；对于高倍图像，右侧为20μm。NFATc4和DAPI的高倍图像（第三栏）显示，在注射了AAV-GFP的APP/PS1小鼠中检测到NFATc5的募集增加。B核和细胞质之间的NFATc4免疫荧光强度比值在所有测试组中均呈正态分布。然而，与AAV-VIVIT和AAV-NLS-VIVIT治疗的动物相比，注射AAV-GFP的APP/PS1小鼠的值更高。在图中，蓝线表示注射AAV-GFP的APP/PS1小鼠NFATc4核质比的平均值。与AAV-VIVIT-GFP和AAV-NLS-VIVIT-GWP相比，AAV-GFP转基因小鼠的核质比显著增加(第页< 0.05). (n个每组分析4只动物，每只分析3片）。
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