Targeted gene inactivation of calpain-1 suppresses cortical degeneration due to traumatic brain injury and neuronal apoptosis induced by oxidative stress

doi:10.1074/jbc.M111.302612

.2012年4月13日；287(16):13182-93.

doi:10.1074/jbc。M111.302612。 Epub 2012年2月24日。

钙蛋白酶-1靶向基因失活抑制创伤性脑损伤引起的皮层变性和氧化应激诱导的神经元凋亡

Kaori H Yamada公司¹, 多萝西·科兹洛夫斯基, 斯泰西·塞德尔, 史蒂文·兰斯, 亚当·J·威施豪斯, 普雷曼和桑迪瓦卡姆, Chinnaswamy Tiruppathi公司, 伊姆兰·奇什蒂, Ira M赫尔曼, 沙菲·M·库恰, 阿塔尔·H·奇什蒂

附属公司

PMID： 22367208
预防性维修识别码：项目经理339949
内政部： 10.1074/jbc。M111.302612号

钙蛋白酶-1靶向基因失活抑制创伤性脑损伤引起的皮层变性和氧化应激诱导的神经元凋亡

山田花梨等。生物化学杂志. 2012.

.2012年4月13日；287(16):13182-93.

doi:10.1074/jbc。M111.302612。 Epub 2012年2月24日。

作者

Kaori H Yamada公司¹, 多萝西·科兹洛夫斯基, 斯泰西·塞德尔, 史蒂文·兰斯, 亚当·J·威施豪斯, 普雷曼和桑迪瓦卡姆, Chinnaswamy Tiruppathi公司, 伊姆兰·奇什蒂, 伊拉·赫尔曼, Shafi M Kuchay公司, 阿塔尔·H·奇什蒂

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿塔夫茨大学医学院分子生理学和药理学系，邮编02111。

PMID： 22367208
预防性维修识别码：项目经理339949
内政部： 10.1074/jbc。M111.302612号

摘要

钙蛋白酶是钙调节的半胱氨酸蛋白酶，参与细胞死亡途径的调节。在这里，我们使用我们的钙蛋白酶-1缺失小鼠模型来评估钙蛋白酶-1在啮齿动物创伤性脑损伤模型后神经退行性变中的功能。在体内，与野生型同窝鼠相比，钙蛋白酶-1基因缺失小鼠在损伤后3天表现出明显较少的神经变性和凋亡，挫伤较小。钙蛋白酶-1神经元对氧化应激诱导的细胞凋亡的抵抗证实了对创伤性脑损伤的保护作用。生化分析显示，钙调素-1缺失神经元的caspase-3激活、细胞外钙进入、线粒体膜通透性以及线粒体释放凋亡诱导因子均被部分阻断。这些发现表明，calpain-1基因敲除小鼠可以作为一个有用的模型系统，用于创伤性脑损伤和其他氧化应激起作用的神经退行性疾病中的神经元保护和凋亡。

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数字

**图1。**
与WT同窝小鼠相比，钙蛋白酶-1 KO小鼠的剩余皮层体积显著增大(E类；*，第页< 0. 02). 此参数表示挫伤较小。切片前的挫伤表面图片显示了calpain-1 KO小鼠的较小挫伤(A类和B类)以及挫伤中心的Nissl染色冠状切片(C类和D类). 样本大小为KO=7和WT=6。

**图2。**
福建⁺在两个WT的挫伤部位周围都观察到神经元(A类)和钙蛋白酶-1 KO(B类)老鼠。然而，FJ的密度⁺钙蛋白酶-1 KO小鼠的神经元显著减少(C类; *,第页< 0.002).比例尺，25微米。*D、，*TUNEL总数⁺与WT（*，第页< 0.04). 样本大小为KO=7和WT=6。

**图3。**
**钙蛋白酶-1 KO神经元对氧化应激诱导的细胞凋亡具有抗性。** *A中，*TUNEL法检测培养神经元的凋亡。微分干涉对比显微镜图像显示有/无氧化应激的神经元的形态。FITC标记显示DNA片段化的细胞。*酒吧，*20微米。*B、，*培养神经元中TUNEL阳性细胞的定量分析。WT和KO胚胎的神经元分别有24.6±5.6和14.5%±2.5%的TUNEL阳性细胞。氧化应激后，WT和KO神经元分别为41.1±4.7和24。TUNEL阳性细胞分别为±4.7%。每次测量都要计算500多个细胞，实验重复四次。图中显示了具有标准误差的TUNEL阳性细胞的平均值（%）。使用Excel进行双向方差分析。F类H值₂O（运行）₂治疗组和基因型分别为8.7和8.5。它们比F类关键4.7。相应的第页值分别为0.012和0.012，表明治疗组和基因型之间存在显著差异。治疗与基因型的交互作用为0.49。使用Bonferoni方法和GraphPad InStat进行事后多重比较。星号指示具有第页根据Bonferoni多重比较测量，值小于0.05。*C、，*Western blotting显示培养神经元中钙蛋白酶-1、钙蛋白酶-2、前半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和裂解半胱氨酸蛋白酶-3的表达。在野生型和杂合子神经元中用多克隆抗体检测内源性钙蛋白酶-1。由于抗体与钙蛋白酶-2的交叉反应，KO神经元显示出一条微弱的80kDa带。

**图4。**
**使用抗活性caspase-3抗体对凋亡和非凋亡人群进行流式细胞术分析。** *A中，*流式细胞术检测培养神经元中裂解的caspase-3阳性细胞。氧化应激6小时后，使用与PE结合的抗裂解caspase-3抗体分析神经元。MDL是一种泛钙蛋白抑制剂。DMSO用作车辆。这个*直方图*显示PE的强度(x个轴线；10⁰, 10¹, 10², 10^三、和10⁴来自左边)以及检测细胞的事件数年轴。*右侧峰值*代表裂解的caspase-3阳性细胞。*B、，*绘制了裂解caspase-3阳性细胞的比率与单元格的总数。PE-阳性细胞表示为平均值±S.E.（WT，25%；WT+H₂O（运行）₂，36±2.7%；重量+高度₂O（运行）₂+MDL，29±1.2%；KO，25±0.21%；KO+H（KO+H）₂O（运行）₂, 27 ± 2.8%; KO+H（KO+H）₂O（运行）₂+MDL，22%）。这个第页使用Tukey-Kramer多重比较试验和Graphpad InStat通过单向方差分析计算值。星号指示具有第页值小于0.05。实验至少重复了两次。*C、，*用与颜色报告分子偶联的caspase-3特异肽（DEVD）测定caspase-2的活性*第页-*硝基苯胺。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3对肽的裂解在405 nm波长下进行分光光度定量。与未经处理的WT相比，caspase-3的相对活性显示在图表（重量+小时₂O（运行）₂, 2.4 ± 0.02; KO，0.57±0.01；KO+H（KO+H）₂O（运行）₂, 1.32 ± 0.06). 实验至少重复了两次。对显著性进行双向方差分析。F类治疗、基因型及其相互作用的值分别为3617、1784和331，大于F类关键7.7。使用Bonferroni方法和GraphPad InStat进行事后多重比较。星号指示具有第页值小于0.05。

**图5。**
**钙蛋白酶-1调节钙²⁺输入。** *A中，*在DIV7，神经元被加载Fura-2乙酰氧基甲酯并用于测量H₂O（运行）₂-诱导[Ca增加²⁺]*_我.固体*和虚线分别表示WT和calpain-1 KO的340:380比率。分析了40多个神经元，带标准误差的平均值显示为*图表。B、，*同样，基础钙²⁺不带H的条目₂O（运行）₂在WT和calpain-1 KO神经元中测量。

**图6。**
**钙蛋白酶-1介导线粒体膜电位的丧失。**氧化应激6小时后，用Rh123孵育神经元。洗涤后，用流式细胞仪分析线粒体中反映线粒体膜电位的剩余Rh123信号。环孢菌素A是线粒体膜通透性的抑制剂。MDL是钙蛋白酶的抑制剂。定量分析Rh123阳性细胞的相对比率如图表平均值±S.E.（未经诱导的杂合值设为1；杂合子+H₂O（运行）₂; 0.63 ± 0.01; 杂合+H₂O（运行）₂+MDL为0.89±0.12；杂合+H₂O（运行）₂+环孢素A，0.95±0.10；KO，0.91±0.09；KO+H（KO+H）₂O（运行）₂, 0.89 ± 0.01; KO+H（KO+H）₂O（运行）₂+MDL为0.82±0.06）。实验至少重复了两次。这个第页使用Graphpad InStat通过Tukey-Kramer单向方差分析计算该值。星号指示具有第页值小于0.05。

**图7。**
**钙蛋白酶-1诱导氧化应激后线粒体释放AIF。** *A中，*氧化应激后6h，神经元分离为线粒体、胞浆和膜组分。通过Western blotting分析细胞液中是否存在AIF。用于监测细胞分馏的标记物包括GAPDH（胞浆）和电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1（线粒体）。*B、，*线粒体释放AIF的定量分析如图所示图表胞浆中AIF信号的强度由GAPDH的强度标准化。细胞溶质中AIF的标准化量显示为比率与无氧化应激控制。进行了三个独立的实验，平均值±S.E.如图表。由于WT和杂合小鼠显示出相似的结果，我们将这些数据组合在一起，如图所示第页使用Tukey-Kramer多重比较试验和Graphpad InStat通过单向方差分析计算值。星号指示具有第页值小于0.05。*C、，*显示建议模型的示意图。氧化应激诱导钙释放，激活钙蛋白酶-1。激活的钙蛋白酶-1反过来介导进一步的钙²⁺进入，形成正反馈回路。然后，激活的钙蛋白酶-1诱导线粒体膜通透性并从线粒体释放AIF。钙蛋白酶-1也激活caspase-3。释放的AIF和活化的caspase-3共同诱导DNA断裂和凋亡。这种凋亡途径在钙蛋白酶-1阴性神经元中被阻断，表明钙蛋白酶-1在神经元凋亡中的作用。

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