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.2012;7（2）：e28382。
doi:10.1371/journal.pone.0028382。 Epub 2012年2月15日。

人副流感病毒1型的C蛋白通过在晚期内体的核周聚集物中结合并保留Stat1来阻断IFN信号

亨利克·肖马克 1, 丽贝卡·M·希伯纳, 吉姆·博尼亚拉塔纳科伦基特（Jim Boonyaratanakornkit）, 索尼娅·苏尔曼, Emerito Amaro-Carambot公司, 彼得·柯林斯, 亚历山大·施密特
附属公司

人副流感病毒1型的C蛋白通过在晚期内体的核周聚集物中结合并保留Stat1来阻断IFN信号

亨利克·肖马克等。 公共科学图书馆一号. 2012.

摘要

干扰素（IFN）在抗病毒免疫反应中起着至关重要的作用。野生型人类副流感病毒1型（WT HPIV1）的C蛋白抑制干扰素-β的诱导和信号传导，而编码C蛋白中单个氨基酸替代（F170S）的HPIV1突变体无法阻断宿主的任何一种应答。在这里，在Vero细胞中检测了1型干扰素受体下游的信号传导，以确定WT HPIV1在什么阶段可以阻断，而F170S HPIV1未能阻断干扰素信号。WT HPIV1抑制Stat1和Stat2的磷酸化，并且这种抑制对于F170S HPIV1仅轻微降低。未观察到Stat1或Stat2的降解。发现HPIV1 C蛋白积聚在核周间隙，通常形成大颗粒，并与Stat1和作为晚期内体标记的阳离子非依赖性甘露糖6-磷酸受体（M6PR）共定位。用干扰素-β刺激后，WT和F170S C蛋白均保留在核周间隙，但只有WT C蛋白阻止Stat1向核移位。此外，WT HPIV1 C蛋白，而不是F170S C蛋白，共同免疫沉淀了磷酸化和非磷酸化的Stat1。我们的研究结果表明，WT HPIV1 C蛋白在与M6PR共定位的核周颗粒中与Stat1形成稳定的复合物，并且WT HPIV1 C蛋白与Stat1之间的直接相互作用是HPIV1抑制IFN信号的能力的基础。HPIV1 C中的F170S突变没有阻止与Stat1的核周共定位，但明显减弱了这种相互作用，因此在IFN刺激下，Stat1转移到细胞核以诱导抗病毒反应。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。用干扰素-α、-β或-γ治疗后WT或F170S HPIV1感染的Vero细胞中的信号传递，通过VSV-GFP斑块形成进行检测。
Vero细胞被模拟感染或感染WT或F170S HPIV1，MOI为5 TCID50/单元格。48小时后，模拟处理细胞或用100或1000 IU/ml的指示干扰素处理细胞24小时。随后，用表达GFP的VSV感染细胞，48小时后计数VSV斑块。抑制VSV菌斑形成是IFN信号产生抗病毒状态的一个迹象。显示了相对斑块数，即非干扰素治疗孔中形成的斑块数的百分比。用100或1000IU的三种IFN中的任何一种刺激的WT和F170S HPIV1感染细胞在限制VSV斑块形成的能力方面显著不同（显示了双尾T试验的P值）。
图2
图2。用干扰素-α、-β或-γ治疗后，对WT或F170S HPIV1感染的Vero细胞中的总Stat1和Stat2和磷酸化Stat1进行Western blot。
Vero细胞被模拟感染或感染WT HPIV1、F170S HPIV1或HPIV2，MOI为5 TCID50/单元格。48小时后，用1000 IU/ml的指示干扰素模拟处理或处理细胞30分钟。A） 蛋白质印迹检测总或磷酸化（p）Stat1和Stat2，以及HPIV1 C蛋白和HPIV2 p蛋白。采用α-管蛋白作为负荷控制。B） 图2A中顶部面板的长期暴露（过夜）[“pStat1（Tyr701）”]表明，在未经干扰素治疗的情况下，在感染WT HPIV1的细胞中检测到低水平的pStat1。
图3
图3。干扰素治疗后Stat1在WT或F170S HPIV1感染Vero细胞中的细胞内定位。
Vero细胞被模拟感染或感染WT或F170S HPIV1，MOI为1 TCID50/细胞，48小时后用1000 IU/ml的IFN-β模拟处理（-IFN）或处理（+IFN）1小时。细胞被固定、渗透，用HPIV1表面蛋白（绿色）和Stat1（红色）抗体进行免疫染色，用DAPI染色以显示细胞核（蓝色），并用共聚焦显微镜进行分析。显示了具有代表性的字段。总的来说，在干扰素β治疗后，2%的WT HPIV1感染细胞和82%的F170S HPIV1受感染细胞显示出核Stat1。
图4
图4。干扰素治疗后Stat2在WT或F170S HPIV1感染Vero细胞中的细胞内定位。
按照图3图例中的描述对细胞进行感染和分析，但抗Stat1的抗体被抗Stat2的抗体取代（红色）。显示了具有代表性的字段。总的来说，在干扰素-β治疗后，2%的WT HPIV1感染细胞和100%的F170S HPIV1受感染细胞显示出核Stat1。
图5
图5。WT HPIV1 C蛋白和Stat1的共免疫沉淀。
用表达myc标记的C′的pcDNA3.1（+）质粒转染293个T细胞重量或C′F170S型蛋白质或未标记CAT作为阴性对照。48小时后，用1000 IU/ml的IFN-β模拟处理（IFN-）或处理（IFN+）细胞30分钟。用抗myc抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀。如左图所示，在SDS-PAGE凝胶上分离全细胞裂解物和沉淀物，并用pStat1、Stat1或C蛋白抗体进行Western blot分析。实验进行了三次，结果相当。
图6
图6。Vero细胞中Stat1和HPIV1 C蛋白的共定标。
Vero细胞被模拟感染或感染WT或F170S HPIV1，MOI为1 TCID50/单元格。48小时后，模拟处理细胞（−IFN）或用1000 IU/ml的IFN-β（+IFN）处理细胞30分钟。随后固定、渗透细胞，并染色HPIV1 C蛋白（红色）和内源性Stat1蛋白（绿色）。图6的Z堆栈如视频S1、S2、S3、S4所示。
图7
图7。Vero细胞中C蛋白和甘露糖6-磷酸受体的共定域。
按照图6所述处理Vero细胞。对细胞进行HPIV1 C蛋白（红色）和M6PR（绿色）染色。图7的Z堆栈如视频S5、S6、S7、S8所示。
图8
图8。Vero细胞中Stat1和甘露糖6-磷酸受体的共放大。
按照图6所述对Vero细胞进行处理。对细胞进行Stat1（红色）和M6PR（绿色）染色。图8的Z堆栈如视频S9、S10、S11、S12所示。
图9
图9。Vero细胞中Stat2和甘露糖6-磷酸受体的共放大。
按照图6所述处理Vero细胞。用Stat2（红色）和M6PR（绿色）对细胞进行染色。图9的Z堆栈如视频S13、S14、S15、S16所示。
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