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.2012年4月；180(4):1441-53.
doi:10.1016/j.ajpath.2011.12.039。 Epub 2012年2月17日。

肾纤维化过程中Hedgehog-Gli通路的激活

史蒂文·法比安 1, Radostin R Penchev公司, 贝诺伊特·圣雅克, Anjali N Rao公司, 佩特拉·西皮拉, Kip A西区, 安德鲁·P·麦克马洪, 本杰明·D·汉弗莱斯
附属公司

肾纤维化过程中Hedgehog-Gli通路的激活

史蒂文·法比安等。 美国病理学杂志. 2012年4月.

摘要

刺猬（Hedgehog，Hh）信号通路调节发育过程中的组织模式，包括肢体和面部的模式和生长，但Hh信号是否在成人肾脏中起作用尚不明确。在这项研究中，使用一组刺猬报告小鼠，我们表明两种Hh配体（印度刺猬和声波刺猬配体）在肾小管上皮细胞中表达。我们报告Hh效应物（Gli1和Gli2）仅在相邻的血小板衍生生长因子受体β阳性间质周细胞和血管周围成纤维细胞中表达，表明存在旁分泌信号环。在两种肾纤维化模型中，Indian Hh配体上调，下游Gli效应器表达显著激活。Hh-反应性Gli1-阳性间质细胞在纤维化过程中经历了11倍的增殖扩张，Gli1-和Gli2-阳性细胞均分化为α-平滑肌肌动蛋白阳性肌成纤维细胞。在周细胞样细胞系10T1/2中，刺猬配体触发了细胞增殖，提示在肾纤维化发展过程中，此途径可能在调节肌成纤维细胞祖细胞的细胞周期进展中发挥作用。刺猬拮抗剂IPI-926在体内消除了Gli1诱导，但没有减少肾纤维化。然而，Gli2的转录诱导不受IPI-926的影响，这表明该模型中存在平滑的非依赖性Gli激活。本研究首次详细描述了成年肾脏中的旁分泌刺猬信号，这表明刺猬-Gli信号可能在纤维化慢性肾脏疾病中发挥作用。

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图1
图1
小鼠肾脏中刺猬（Hh）通路的表达模式。报告鼠声刺猬（Shh）-GFPCre；R26 LacZ Ihh nLacZ、Ptch1 nLacZ、Gli1 nLacZ和Gli2 nLacZ成年小鼠），就地杂交和定量PCR用于测量和定位Hh途径的表达。现场结果来自P1肾脏；报告鼠和定量PCR均来自成年鼠。答：Shh仅见于乳头（p）和输尿管(箭头). Ihh在内侧皮质和髓质（m）中表达，Ptch1在皮质（c）、髓质和乳头中表达。印度刺猬（Ihh）和Patched1（Ptch1）在皮质髓质交界处均表现出显著染色。B类：Gli1和Gli2在皮质、髓质和乳头中表达，尽管与Ihh和Ptch1相似，Gli1在皮质髓质交界处最高，而Gli2则在内侧髓质和乳突中最高。C–E：定量PCR证实了所有Hh途径成员的区域表达差异：Shh、Ihh、沙漠刺猬（Dhh）(C类); 第1部分(D类); Gli1、GLi2、Gli3(E类).N个=3只小鼠*P（P）< 0.05, **P（P）<0.005，以及***P（P）通过方差分析和Tukey后验得出<0.001。虚线表示皮质髓质和髓乳头交界处。比例尺=50μm。
图2
图2
Hedgehog（Hh）配体在肾小管上皮细胞中表达，间质细胞对Hh配体产生反应。LacZ表达和就地杂交显示声波刺猬（Shh）和印度刺猬的表达仅限于肾小管上皮细胞。答：Shh-GFPCre的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷（X-gal）染色；R26-LacZ肾脏和随后的水通道蛋白2（AQP2）免疫荧光检测表明Shh在集合管中表达。B类：在外髓质中，Ihh阳性细胞呈立方形状(箭头)并与近端管状标记物Lotus tetragonolobus lectin（LTL）共同染色。抄送：Patched1（Ptch1）-nLacZ在肾小球（g）、小管（t）、内皮细胞中表达(箭头)和间质(箭头)而Gli1-nLacZ和Gli2-nLacZ的表达仅限于间质细胞。Ptch1、Gli1和Gli2阳性细胞在动脉和小动脉周围的血管周围间隙富集（下三个面板）。比例尺=50μm。nLacZ，核lacZ。
图3
图3
Gli2而非Gli1的表达发生在发育中肾脏肾原区的输尿管芽上皮细胞中。答：Gli1-nLacZ小鼠肾脏的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷（X-gal）染色仅为间质染色，未显示输尿管芽上皮染色(箭头)P0和P7小鼠。B类：Gli2-nLacZ小鼠肾脏X-gal染色显示输尿管芽上皮染色(箭头)在新生小鼠的外皮层中（P0）。上皮细胞X-gal染色减少(箭头)在7日龄小鼠的肾脏中（第7页），在14日龄小鼠肾脏中几乎完全缺失（第14页）。比例尺=50μm。nLacz，核LacZ。
图4
图4
Hedgehog（Hh）通路在两种不同的肾纤维化模型中被激活。A–D：在单侧输尿管梗阻（UUO）或假手术后第3、7和14天获得皮质髓质裂解物，mRNA表达归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GADPH）。胶原蛋白1α1（Col1α1）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）(A类)UUO期间增加，证实纤维化。补丁1（Ptch1）(B类)UUO的第14天略有增加。Gli1和Gli3水平(C类)整个UUO期间逐渐升高，第7天和第14天Gli2水平升高。印度刺猬（Ihh）(D类)UUO后显著增加，在第3天达到峰值，而声波刺猬（Shh）和沙漠刺猬的表达最低。N个=每个时间点5只UUO和5只假小鼠。E–H：在缺血再灌注损伤（UIRI）后第3、7、14和28天，或假手术后第3天，获取纤维标志物Gli1、Gli2、Gli3和Ptch1的髓质裂解物和Ihh的皮质裂解物。mRNA表达按GAPDH标准化。类似于第7天Col1α1和α-SMA的峰值增加(E类)、Gli1、Gli2、Gli3(G公司)，Ihh(H（H）)，以及程度较低的Ptch1(F类)，UIRI后增加，第7天达到峰值。Gli1在第28天也出现了第二个峰值。N个=4只小鼠，用于UIRI第1、3、14和28天，以及N个=3只小鼠用于UIRI第7天和假手术*P（P）< 0.05, **P（P）<0.005，以及***P（P）通过Dunnett的后验进行方差分析，<0.001。
图5
图5
在单侧输尿管梗阻（UUO）期间，表达Gli1、Gli2和Patched1（Ptch1）的细胞数量增加。答：Gli1-nLacZ小鼠肾切片的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷（X-gal）染色的低倍图像显示，随着UUO持续时间的增加，X-gal染色逐渐增加。B类：来自的盒装区域的高功率图像A类证明Gli-nLacZ阳性细胞只存在于间质。抄送：对肾皮质中Gli1-nLacZ阳性细胞数量的量化显示，UUO期间细胞数量显著增加。医生：Gli2和Ptch1的X-gal染色显示，与未损伤的肾脏相比，7天UUO肾脏中X-gal阳性间质细胞的数量增加。X-gal染色法检测印度刺猬（Ihh）的表达仍然局限于未受损肾脏和UUO肾脏的小管。电子邮箱：大脑皮层和髓质中每200×视野中表达Gli2的细胞数量增加，尽管大脑皮层的增加不如Gli1的显著。皮质每100×视野中表达Ptch1的细胞在间质中增加，但在小管中没有增加。Ihh-nLacZ小鼠在UUO期间，每100×视野的皮层X-gal阳性细胞数量没有增加。N个=Gli1和Ptch1每个时间点4只小鼠，以及N个=Gli2和Ihh的每个时间点3只小鼠。比例尺=50μm*P（P）< 0.05, **P（P）<0.005，以及***P（P）通过Dunnett的后验进行方差分析，<0.001。CLK，对侧肾；nLacZ，核LacZ。
图6
图6
Gli1、Gli2和Patched1（Ptch1）阳性间质细胞共同表达周细胞标记物血小板衍生生长因子受体-β（PDGFR-β），并在单侧输尿管梗阻（UUO）肾脏中获得肌成纤维细胞标记物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达。为了确定哪些间质细胞类型在未损伤和损伤的肾脏中表达Gli1、Gli2和Ptch1，对Gli1-nLacZ、Gli2-nLacZ和Ptch1-nLac Z小鼠第7天的UUO和对侧（CLK）肾脏切片进行nLacC免疫荧光联合标记，并从肾内皮质获得各种细胞类型特异性标记物和图片。所有三只报告小鼠间质细胞中的nLacZ与周细胞标记物PDGFR-β在CLK中共定位(箭头)和UUO肾脏。所有三只报告小鼠间质细胞中的nLacZ与UUO肾脏中的肌成纤维细胞标记物α-SMA共定位。表达Gli1、Gli2和Ptch1的细胞通常与表达巨噬细胞标记物F4/80和内皮标记物CD31的细胞密切接触，尽管这些细胞中的绝大多数并不共同表达这些标记物(插入)用于CLK和UUO。nLacZ，核LacZ。
图7
图7
单侧输尿管梗阻（UUO）早期表达Gli1的细胞增殖增加，用Hedgehog（Hh）激动剂刺激周细胞样细胞系可诱导细胞增殖在体外.答：为了确定Gli1-nLacZ小鼠第0、3和7天UUO肾脏的切片是否在UUO期间表达Gli1的细胞增殖增加，对nLacZ和Ki-67进行了联合标记。B类：通过划分nLacZ+的数量来确定Ki-67共染色的nLacZ阳性细胞的百分比；Ki-67+双阳性细胞(箭头)外髓质中nLacZ阳性细胞的总数。比例尺=25μm。N个=3只小鼠，第0天和第7天；N个=第3天4只小鼠。与第0天和第7天相比，第3天与Ki-67共染的Gli1-nLacZ细胞百分比更高。抄送：定量PCR评估，用声波刺猬配体（Shh）或平滑激动剂（SAG）刺激10T1/2细胞可诱导Gli1的大幅度上调。血小板衍生生长因子（PDGF）和转化生长因子（TGF-β）均无影响。D、 电子：10T1/2细胞经碘化丙啶标记后，用荧光激活细胞分选法对其进行分析(D类)、SAG(E类)，或10%胎牛血清（FBS）显示，与用于Shh的Cos7对照培养基和用于SAG的水介质对照相比，S+G2M中的细胞百分比增加，G1中的细胞百分比降低。F、 德国：5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU）摄取阳性的10T1/2细胞百分比随着Shh刺激而增加(F类)，凹陷(G公司)或与Cos7控制介质或车辆控制相比，FBS为10%。N个=每种情况3*P（P）< 0.05, **P（P）<0.005，以及***P（P）<0.001，通过Dunnett后验的方差分析(B类和D–G型)和双尾学生t吨-测试(C类). nLacZ，核LacZ。
图8
图8
IPI-926抑制单侧输尿管梗阻（UUO）肾脏的Hedgehog（Hh）信号。答：为了确定IPI-926是否抑制Hh信号，IPI-925（40 mg/kg）(N个=5）或车辆(N个=5）从UUO前一天开始，每天给Gli1-nLacZ小鼠灌胃8天。在UUO第7天处死小鼠。B类：与对侧肾脏（CLK）相比，经IPI-926治疗的小鼠在车辆治疗的Gli1-nLacZ小鼠的UUO肾脏切片中看到的皮质5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷（X-gal）染色的增加完全被消除。抄送：用IPI-926盲法处理BALB/c小鼠UUO和CLK肾裂解物中Gli1、Gli2、Gli3和Patched1（Ptch1）的mRNA表达(N个=6）或车辆(N个=8）显示CLK和UUO中Gli1表达受到抑制。与CLK相比，IPI-926未抑制UUO中Gli2和Gli3表达的增加。在UUO第10天处死BALB/c小鼠，从手术前2天开始，每天用IPI-926 40 mg/kg或载体治疗12天*P（P）< 0.05, **P（P）<0.005，以及***P（P）<0.001，双尾学生t吨-测试。
图9
图9
IPI-926不能减少单侧输尿管梗阻（UUO）患者的肾纤维化。答：通过定量PCR对BALB/c小鼠第10天UUO皮质髓质肾裂解物中纤维化标记物的mRNA表达进行定量PCR，IPI-926治疗12天后未降低(N个=6）与车辆治疗相比，手术前2天开始(N个= 8).B类：与对侧肾脏（CLK）相比，经Western blot测定并通过积分光密度（IOD）定量的UUO中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白表达的增加在IPI-926治疗中没有受到抑制。C类和医生：毛状污渍(C类)来自C57BL/6小鼠的UUO第10天肾脏切片，并进行盲法评分(D类)病理学家测定的间质纤维化/输卵管萎缩百分比（IF/TA%）在IPI-926治疗组和对照组之间没有差异(N个=6）和车辆处理组(N个= 7). C57BL/6小鼠在UUO前2天开始每天服用IPI-926（40 mg/kg）或载体12天。ns，双尾Student的无显著性t吨-测试。
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