Inhibition of pyrimidine synthesis reverses viral virulence factor-mediated block of mRNA nuclear export

doi:10.1083/jcb.201107058

.2012年2月6日；196(3):315-26.

doi:10.1083/jcb.201107058。

抑制嘧啶合成逆转病毒毒力因子介导的mRNA核输出阻滞

梁张¹, Priyabrata Das公司, 米尔科·施莫尔克, 巴拉吉·曼尼卡萨米, 王亚明（Yaming Wang）, 邓小平孝义, 凌才, 本杰明·P·图, 克里斯蒂安·福斯特, 迈克尔·G·罗斯, 大卫·E·利维, 阿道夫·加西亚·萨斯特雷, 杰夫·德·布拉班德, 玛格丽特·菲利普斯, Beatriz M A Fontoura公司

附属公司

PMID： 22312003
预防性维修识别码： PMC3275370型
内政部： 10.1083/jcb.201107058

抑制嘧啶合成逆转病毒毒力因子介导的mRNA核输出阻滞

梁张等。 J细胞生物学. 2012.

.2012年2月6日；196(3):315-26.

doi:10.1083/jcb.201107058。

作者

梁张¹, Priyabrata Das公司, 米尔科·施莫尔克, 巴拉吉·曼尼卡萨米, 王亚明（Yaming Wang）, 邓小平孝义, 凌才, 本杰明·P·图, 克里斯蒂安·V·福斯特, 迈克尔·G·罗斯, 大卫·E·利维, 阿道夫·加西亚·萨斯特雷, 杰夫·德·布拉班德, 玛格丽特·菲利普斯, Beatriz M A Fontoura公司

附属

¹美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心细胞生物学系，邮编75390。

PMID： 22312003
预防性维修识别码： PMC3275370型
内政部： 10.1083/jcb.201107058

摘要

流感病毒的NS1蛋白是病毒复制所必需的主要毒力因子，因为它重定向宿主细胞以促进病毒蛋白表达。NS1抑制细胞信使核糖核酸（mRNA）的加工和输出，下调宿主基因表达，增强病毒基因表达。我们在本文中报道了一种无毒喹啉羧酸的鉴定，该羧酸可在无病毒或有病毒的情况下，逆转NS1对mRNA核输出的抑制。这种喹啉羧酸直接抑制二氢鸟酸脱氢酶（DHODH），这是从头合成嘧啶所需的宿主酶，并部分降低嘧啶水平。这种效应诱导NXF1表达，在NS1存在时促进mRNA核输出。在水疱性口炎病毒M（基质）蛋白（另一种病毒mRNA输出抑制剂）存在的情况下，通过DHODH抑制释放NS1介导的mRNA输出阻断。这种mRNA输出阻断的逆转允许抗病毒因子的表达。因此，嘧啶在毒力因子抑制mRNA核输出中起着必要的作用。

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数字

**图1。**
**喹啉羧酸靶向DHODH并逆转NS1诱导的宿主基因表达阻断。**（A）的结构1，一种喹啉羧酸。（B）在不存在或存在5µM的情况下，对293T细胞进行荧光素酶报告基因检测，该细胞转染有单独编码荧光素素酶的质粒或与编码NS1的质粒共同转染1如图所示。通过免疫印迹分析测定NS1和β-肌动蛋白水平。（C）的类比1（D）抑制人DHODH的剂量-反应曲线。抑制剂浓度在三倍稀释系列中变化（0.01–100µM），并且测定了相对于无抑制剂对照的抑制百分比（v_我/v（v）_o个× 100). 将收集到的三份数据拟合到Prism中的对数[I]与响应（三参数）方程，以确定IC₅₀。括号中给出的值是安装的IC₅₀值。来氟米特的活性代谢物A77 1726用作对照，并给出IC₅₀=0.25（0.13–0.47）µM。（E）的模型**1-14**绑定到DOCK生成的人类DHODH。**1-14**（绿松石）对接到人类DHODH结构（紫色）中。ABBA是在2B0M中与DHODH共结晶的原始配体，显示为品红色，黄素单核苷酸（FMN）显示为黄色，乳清酸盐（oro）显示为紫色，氮显示为蓝色，氧显示为红色。活性位点残基被标记。ABBA是一种氯喹类似物。（F）用液相色谱MS/MS测定HBEC中尿苷核苷酸的相对丰度**1-14**。使用MRM定量细胞内UTP、UDP和UMP水平。结果表示平均值±SD；**，P<0.01。

**图2。**
**喹啉羧酸通过DHODH抑制病毒复制。**（A） HBEC未感染或感染A/WSN/1933，MOI为1。用**1-14**和/或后处理**1-14**在指定的时间点添加，持续24小时。使用针对各种流感病毒蛋白的抗体对细胞提取物进行免疫印迹分析。（B） HBEC感染A/WSN/1933，MOI为0.01，并且**1-14**在感染后1h加入不同浓度的。病毒复制通过斑块分析进行测量。（C） MDCK细胞以0.001的MOI感染A/WSN/1933 48小时，并与DMSO孵育，1,**1-10**、和**1-14**在没有（对照）或存在500µM尿苷（U）、胞苷（C）、腺苷（A）或鸟苷（G）的情况下。通过菌斑试验测定病毒滴度。（D） MDCK细胞以0.001的MOI感染A/WSN/1933 48小时，并与DMSO或**1-14**在不存在或存在50或500µM乳清酸的情况下。通过菌斑试验测定病毒滴度。结果代表平均值±SD；**，P<0.01。感染后感染；pfu，斑块形成单元。

**图3。**
**喹啉羧酸释放流感病毒诱导的mRNA输出阻滞。**（A） HBEC在没有或存在1µM的情况下，以1的MOI感染A/WSN/1933或A/WSN/1933-ΔNS1 30 h1-14使用针对所有流感病毒蛋白的抗体对细胞进行寡核苷酸（T）原位杂交和免疫荧光。在倒置显微镜（Axiovert 200M）中观察细胞。DAPI染色细胞核。棒材，20µM。（B）聚（A）核滞留细胞的定量⁺A中的RNA。呈现poly（A）核滞留的细胞百分比⁺相对于显示poly（A）正态分布的细胞计算RNA⁺细胞核和细胞质中的RNA。对每种条件下的500个细胞进行计数。结果代表平均值±SD；**，P<0.01。

**图4。**
**嘧啶生物合成调节NS1靶向宿主mRNA的核输出。**（A）通过报告质粒和编码NS1的质粒的共转染，在293T细胞中进行荧光素酶基因表达测定。用化合物处理细胞1（5µM）或**1-14**（1µM），并测量荧光素酶活性。与A中的细胞裂解物一样，使用针对所示蛋白质的抗体进行免疫印迹分析。（B）单独转染质粒或表达NS1质粒的HeLa细胞与DMSO，1µM化合物孵育**1-14**单独或复合**1-14**在500µM尿苷存在下。然后用抗NS1抗体对细胞进行寡核苷酸（T）原位杂交和免疫荧光。棒材，15µM。（C）聚（A）核滞留细胞的定量⁺B中的RNA。呈现聚（A）核滞留的细胞百分比⁺计算显示poly（A）正态分布的细胞的RNA⁺RNA在细胞核和细胞质中。每种情况下计数500个细胞。结果代表平均值±SD；**，P<0.01。

**图5。**
**DHODH抑制剂通过增加NXF1水平诱导核输出和编码抗病毒因子的mRNA的表达。**（A）用编码NS1的质粒转染的293T细胞未经处理或用**1-14**从细胞核和细胞质（细胞）组分中分离出RNA，并通过实时RT-PCR定量显示mRNA种类。如图所示，免疫印迹分析显示了组分纯度的控制。（B）用对照质粒或编码NS1的质粒转染293T细胞，并用**1-14**用针对所示蛋白的抗体对总细胞提取物进行免疫印迹分析。（C）用对照质粒或编码NS1的质粒转染293T细胞，并用1或**1-14**用针对所示蛋白的抗体对总细胞提取物进行免疫印迹分析。（D） 293T细胞与一个控制质粒或编码NS1的质粒以及靶向NXF1的控制siRNA寡核苷酸（SCR）或siRNA共同转染。从细胞核和细胞质部分分离RNA，并通过实时RT-PCR对所示的mRNA物种进行定量。如图所示，通过免疫印迹分析显示了NXF1敲低的对照。结果表示平均值±SD；**，P＜0.01。N/C，核/细胞质。

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[1] Akhova O.，Bainbridge M.，Misra V.2005年。神经宿主细胞因子结合蛋白张飞抑制单纯疱疹病毒复制。J.维罗尔。79:14708–14718 10.1128/JVI.79.23.14708-14718.2005-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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