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.2012;7(1):e28504。
doi:10.1371/journal.pone.0028504。 Epub 2012年1月12日。

RGS4介导的支气管平滑肌细胞表型转换促进哮喘固定气道阻塞

附属公司

RGS4介导的支气管平滑肌细胞表型转换促进哮喘固定气道阻塞

乔塔姆·达梅拉等。 公共科学图书馆一号. 2012.

摘要

在严重哮喘患者中,支气管扩张剂和类固醇敏感性气流阻塞是通过未知机制发展而来的,其特征是肺气道平滑肌(ASM)质量和硬度增加。我们探讨了G蛋白信号蛋白调节蛋白(RGS4)在晚期哮喘ASM增生和收缩能力降低中的作用。采用免疫细胞化学染色法,在健康受试者和轻、中、重度哮喘受试者的支气管内活检中检测RGS4的ASM表达。在培养的人类ASM细胞和人类精确切割的肺切片中测定细胞增殖试验、激动剂诱导的钙动员和支气管收缩。使用获得和失去功能的方法,确定RGS蛋白在刺激人类ASM增殖和抑制支气管收缩中的确切作用。RGS4的表达仅限于ASM的一个亚群,并被有丝分裂原特异性上调,这诱导了与顽固性哮喘相似的ASM过度增殖和低收缩表型。RGS4在严重哮喘患者支气管平滑肌中的表达显著增加,且表达与肺功能降低显著相关。虽然RGS4抑制G蛋白偶联受体(GPCR)介导的支气管收缩,但PDGF诱导的增殖和PI3K(一种调节ASM增殖的有丝分裂信号分子)的持续激活却意外地需要RGS4。这些研究表明,RGS4表达的增加促进了ASM的表型转换,在患有严重哮喘的受试者中引起不可逆的气道阻塞。

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数字

图1
图1。人气道平滑肌(HASM)有丝分裂原诱导RGS4表达。
(A类)HASM细胞表达RGS公司mRNA。RGS公司通过实时PCR测定未经处理或用PDGF处理2 h的HASM细胞中的表达。数据是使用加德夫作为内部控制,相对于RGS2号机组在未经处理的细胞中,设置为“1”。(B类)分析RGS4系列实时PCR检测有丝分裂原如EGF(1 ng/ml)、PDGF(10 ng/ml)、凝血酶和细胞因子在HASM细胞中的表达。5个独立实验的数据(平均值±SEM)。(C类)PDGF介导的动力学RGS4系列mRNA表达随时间的变化。数值(三次执行的三个单独实验的平均值±SEM)与未处理细胞的数值相对,设为“1”(D类)未经处理(顶部)或PDGF处理(底部)的HASM细胞中RGS4的表达,用多克隆抗RGS4免疫染色,然后用Alexa Fluor 488-结合抗IgG和DAPI免疫染色。左图:抗RGS4抗体免疫染色的高倍(650×)可视化显示PDGF后RGS4蛋白的质膜染色。这些数据代表了两个不同细胞系中的三个重复微孔。条形代表50微米。
图2
图2。RGS4的表达与哮喘患者的肺ASM质量和疾病严重程度成比例。
(A类)哮喘ASM束内及其附近的RGS4细胞。哮喘患者(200×)支气管活检的代表性显微照片,用同型对照抗体(最左侧)或抗RGS4抗体(3个右侧面板)染色,包括上皮、固有层和ASM束。最右侧的面板显示了一名单独患者(400×)的活组织切片染色,该患者的α-平滑肌肌动蛋白和RGS4抗体染色。箭头显示RGS4+ASM束内和附近的单元。(B–C类)RGS4编号的点位+单元格/mm2ASM捆绑包中的ASM(B类)或RGS4+单元格/mm2ASM捆绑包内及其附近的ASM(C类)哮喘患者和健康对照组。水平条表示中值(P(P)<0.05,所有跨组比较的Kruskal-Wallis检验;P(P)图中给出了Dunn的后测试值)。(D类)RGS4的相关性+单元格/mm2预测FEV%的ASM1在所有受试者和仅患有哮喘的受试者中,相关系数和P(P)提供的值。
图3
图3。依赖PI3K和Akt的HASM增殖需要RGS4。
(A类)RT-PCR凝胶照片分析RGS4和GAPDH在未经处理和PDGF处理的感染编码两种对照慢病毒的HASM细胞中的表达(ShCnt公司)或RGS4特定(ShRGS4公司)shRNA。(B类)RGS4缺失减弱PDGF介导的HASM增殖。未被改造第4页ShCnt公司ASM细胞缺血清24小时,然后用无血清培养基或含有PDGF的培养基再处理72小时。使用贝克曼细胞库特计数器测定总细胞数(在2个细胞系中进行的6次单独实验的平均值±SEM)。(C类)用FACS分析PDGF诱导的24小时后细胞周期的改变ShRGS4公司ShCnt公司HASM细胞。(D类)通过未经处理或PDGF处理的S裂解物的免疫印迹法评估p85α磷酸化的分析hCnt公司ShRGS4公司表达HASM细胞。印迹是在2个细胞系中进行的3个单独实验的代表。(E类)左图:未经处理或PDGF处理的细胞中p-p85 PI3K、RGS4和总p85 PI3G表达的免疫印迹分析。右图:未经处理或PDGF处理的细胞裂解物的免疫印迹分析,用所示抗体免疫沉淀。印迹是在3个细胞系中进行的3个单独实验的代表。(F类)PDGF介导的Akt磷酸化的动力学在ShRGS4公司ShCnt公司ELISA检测HASM细胞。数据(平均值±SEM)表示为基底上的褶皱变化,在5个单独的实验中设置为“1”。(G公司)Akt激酶活性ShRGS4公司ShCnt公司未经处理或PDGF处理的细胞中的HASM细胞。使用特定抗体从总细胞裂解物中免疫沉淀p-Akt(Ser-473),然后与重组GSK3孵育。用比色法测定磷酸GSK-3α/β(Ser-21/9)。数据(平均值±SEM)是车辆处理后的折叠式变化ShCnt公司在4个独立实验中测定的细胞,一式三份。(H(H))总RNA提取自ShRGS4公司ShCnt公司用PDGF或稀释剂处理HASM细胞8小时,然后分析相对细胞周期蛋白D1实时PCR表达。数据是使用2个细胞系的6个独立实验的平均值±SEM。
图4
图4。PDGF显著抑制卡巴胆碱诱导的人小气道支气管收缩。
(A类)从健康供体获得PCLS,用培养基或PDGF(50 ng/ml)处理8 h,然后通过显微镜分析卡巴胆碱诱导的小气道收缩。日志EC50和E最大值这些值(平均值±SEM)是在方法中描述的从4个独立供体获得的16条气道上进行的实验中测定的。(B类)PDGF减弱激动剂诱导的[Ca增加2+]用10 ng/ml PDGF或稀释剂刺激HASM细胞8 h,然后测量[Ca2+]使用Ca2+-在乙酰胆碱(ACh)、组胺或凝血酶刺激后感应荧光团。在300秒的时间内测量单细胞钙瞬变。表中显示峰值[Ca的平均±SEM2+]在30个细胞中测定的水平(P(P)由双尾学生确定的值t吨测试)。底部轨迹表示[Ca2+]在单个单元格中(蓝线 = 对照,稀释液处理;红线=========================================================================PDGF-处理)。中间轨迹表示阴影部分所示的组平均数据±SEM。(C类)RGS4是PDGF介导的激动剂诱导[Ca的衰减所必需的2+]在HASM细胞中。平均响应用粗曲线表示,单个细胞响应用虚线表示。
图5
图5。RGS4在调节人类ASM兴奋-压缩耦合和有丝分裂原诱导增殖中的作用的示意图。
调节性G蛋白信号分子调节激动剂诱导的收缩和生长因子诱导的有丝分裂的模型。生长因子刺激与Ras和Src等小G蛋白偶联的受体酪氨酸激酶(RTK)。然后,Src激活磷脂酰肌醇3-激酶型IA(PI3K)和细胞外受体激酶1/2(ERK1/2)。随后,PI3K激活蛋白激酶B(PKB)和雷帕霉素哺乳动物靶点(mTOR),然后刺激S6激酶(S6K1)磷酸化。S6K1磷酸化诱导RGS和其他细胞周期进展和增殖所需蛋白的表达。RGS的表达与PI3K共定位,并促进PI3K的长时间激活,以促进细胞周期的穿越。激动剂通过激活特定Gα亚单位刺激G蛋白偶联受体(GPCR)。PLCβ刺激然后产生IP通过与IP结合,通过细胞质钙储存调节钙释放和ryanodine受体。钙的增加以肌球蛋白轻链(MLC)激酶依赖的方式促进肌动蛋白跨桥循环。同时,G蛋白激活刺激Rho激酶激活,抑制MLC磷酸酶并促进调节性MLC磷酸化(钙敏感性)。激动剂和生长因子可能以旁分泌或自分泌的方式激活ASM。RTK通路的激活和激动剂介导的力量生成的抑制促进ASM增生,增加ASM质量,并可能导致不可逆的气流阻塞。

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工具书类

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