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.2012年1月16日；13(1):99-107.
doi:10.1002/cphc.201100735。 Epub 2011年12月23日。

基于多参数荧光检测的多色超分辨率荧光成像

马克·贝茨 1, 格雷厄姆·邓普西, 陈国浩, 庄晓伟
附属公司
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基于多参数荧光检测的多色超分辨率荧光成像

马克·贝茨等。 化学物理化学. .
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摘要

了解细胞环境的复杂性将受益于同时以纳米级空间分辨率明确解析多个细胞成分的能力。多色超分辨率荧光显微镜技术已被开发用于实现这一目标，但在可同时成像的目标数量和彩色通道之间的串扰方面仍然存在挑战。在此，我们展示了基于多参数检测策略的多色随机光学重建显微镜（STORM），该策略使用荧光激活波长和发射颜色来区分光激活荧光探针。首先，我们使用近红外菁染料Alexa 750和红色菁染料Alexa 647获得了双色超分辨率图像，并量化了颜色串扰水平和图像配准精度。这两种可切换染料与荧光团的组合配对可以增强光活化，从而实现对六种不同探针的多参数检测。利用这种方法，我们获得了模型样品的六色超分辨率荧光图像。多个荧光检测参数的组合用于改进荧光团鉴别，有望大大增强我们以亚衍射分辨率可视化多个细胞目标的能力。

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数字

图1
图1
Alexa 750的光开关行为及其与Alexa 647的比较。a） 上图：Alexa 750在连续752 nm照明下荧光发射闪烁。底部：Cy3-Alexa 750染料对在连续752 nm照明（红色条表示）和532 nm绿色照明周期脉冲（绿色条表示）下的可逆光驱动开关。532 nm的光在被752 nm的光线关闭后有效地重新激活Alexa 750。b） 与Alexa 647相比，Alexa 750每个开关周期的光子数（红色条）和平衡闪烁分数（或开关占空比，蓝色条）的特征。测量了含有两种不同初级硫醇之一的缓冲液的开关特性：β-巯基乙醇（BME）或β-巯基乙胺（MEA）。
图2
图2
使用双任务通道方案和双激活通道方案拍摄的双色STORM图像的比较。a–c）分别用Alexa 750和Alexa 647免疫染色的BSC-1细胞微管和线粒体的双发射通道STORM成像（未使用激活荧光团）。d–f）分别用Cy3-Alexa 750染料对和Cy3-Allxa 647染料对免疫染色的BSC-1细胞微管和线粒体的双发射通道STORM成像。g–i）分别用Alexa 405-Alexa 647对和Cy3-Alexa 64 7对免疫染色的BSC-1细胞微管和线粒体的双激活通道STORM成像。面板g–i中显示的STORM数据已针对颜色串扰进行了校正（请参阅支持信息）。比例尺500 nm。
图3
图3
使用多参数检测的六色STORM成像。a） 玻璃上链霉亲和素分子的六色STORM图像。链霉亲和素与三种激活荧光团之一（Cy3、Cy2或Alexa 405）和一种光开关报告荧光团（Alexa 647或Alexa750）进行双重标记，并结合在涂有生物素的玻璃盖玻片上（插图）。每个荧光团定位事件都根据之前的激活脉冲波长和检测到它的荧光通道进行颜色编码。比例尺500 nm。b–e）（a）中方框区域的详细视图，显示绘制为十字的位置。紧密聚集的定位群主要由单色组成，显示了每个链霉亲和素分子的标记。比例尺25 nm。
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