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.2012年4月1日；21（7）：1457-69。
doi:10.1093/hmg/ddr582。 Epub 2011年12月13日。

HSC20与frataxin相互作用，参与铁硫簇的生物发生和铁稳态

玉溪山 1, 吉诺·科尔托帕西
附属公司

HSC20与frataxin相互作用，参与铁硫簇生物发生和铁稳态

玉溪山等。 人类分子遗传学. .

摘要

Friedreich共济失调是一种神经退行性疾病，由frataxin基因突变引起，该基因产生一种主要的线粒体蛋白质，其主要功能似乎是线粒体铁硫簇（ISC）生物合成。之前我们证明了frataxin与哺乳动物ISC组装机械的多个组件相互作用。在这里，我们证明了frataxin与哺乳动物线粒体伴侣HSC20相互作用。我们证明了这种相互作用是铁依赖的。我们还表明，与frataxin一样，HSC20与参与ISC生物发生的多种蛋白质相互作用，包括ISCU/Nfs1 ISC生物生成复合物和GRP75 ISC伴侣。此外，HSC20的敲除导致线粒体ISC相关酶活性的功能缺陷以及ISC蛋白表达的缺陷。frataxin表达上调或下调导致HSC20表达反向代偿性改变，正如预期的那样，两个协同蛋白在同一途径中工作，这表明该病可能有治疗策略。HSC20的敲除改变了细胞溶质和线粒体铁库，增加了转铁蛋白受体1和铁调节蛋白2的表达，这与铁的生物利用度降低一致。这些结果表明，HSC20在结构和功能上与frataxin相互作用，对哺乳动物的ISC生物发生和铁稳态具有重要意义。此外，他们认为HSC20可能在ISC途径中起后期作用，作为ISC传递到载脂蛋白的伴侣，并且HSC20应该被纳入哺乳动物ISC生物发生的多蛋白复合物研究中。

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数字

图1。
图1。
ISC蛋白的同源性和功能。显示了frataxin和frataxin-相关铁硫蛋白的同源性，并绘制了可能的功能图。根据参考文献（24）推断。
图2。
图2。
HSC20的克隆与表达。(A类)不同物种HSC20的氨基酸序列比对。相同的序列用黑色框住，相似的序列用灰色框住。四个保守的半胱氨酸用星号标记。(B)不同物种HSC20蛋白的基序分析。(C类)不同物种HSC20蛋白同源物进化关系的系统发育分析。(D类)HSC20在不同小鼠组织和人细胞系线粒体中的表达模式。(E类)HEK293T细胞中HSC20蛋白过度表达。HEK293T细胞转染HSC20-EGFP、HSC20-Flag、HSC20-myc、空EGFP，Frataxin-3Flag和Frataxin-myc。左：细胞被裂解，用抗myc（绿色）和抗Flag（红色）抗体进行western印迹（上面板），然后用抗HSC20（绿色，下面板）剥离并探测相同的印迹。右：用抗GFP（红色）和HSC20（绿色）探测细胞裂解物。(F类)免疫沉淀HSC20进行质谱分析。凝胶上有两条条纹。P、 前驱体；M、 成熟型。对25kDa成熟型带进行测序，获得的N末端残基（下划线）在HSC20序列中的位置。
图3。
图3。
Frataxin与HSC20相互作用。(A类)Frataxin与HSC20相互作用体内通过免疫共沉淀法鉴定HSC20与frataxin之间的相互作用。用pcDNA-Frataxin-HA和pcDNA-HSC20-Flag质粒瞬时转染HEK293T细胞。48小时后，用指示的IgG或抗体对细胞进行裂解、鉴定和免疫沉淀，然后释放不动部分，并用抗Flag（上层）和抗HA抗体（下层）进行免疫印迹。输入：用于联合免疫沉淀的总细胞裂解物的5%。(B)Frataxin与HSC20相互作用在体外.消费税-▵55 frataxin拉下HSC20-GFP。用pEGFPN-HSC20瞬时转染HEK293T细胞。图示为GFP标记的HSC20的表达（车道1）。将GST单独（第2道）或GST标记的frataxin（第3道）结合到珠子上，并与转染pEGFPN-HSC20的HEK293T细胞的裂解物孵育。对珠结合蛋白复合物进行免疫印迹。凝胶用考马斯蓝（上层）染色，用多克隆抗GFP抗体（下层）探测印迹。(C类)frataxin与HSC20的内源性相互作用。YG8小鼠脑用CHAPS缓冲液匀浆，用免疫前血清或HSC20血清免疫沉淀，然后用抗frataxin抗体免疫印迹。(D类)Frataxin与HSC20共同隔离。蓝色天然和SDS–PAGE 2D用于分离线粒体蛋白。将天然组分在梯度凝胶上进行一维分离，然后将凝胶条堆叠在Bis-Tris梯度凝胶上并进行分离，对HSC20和frataxin进行免疫印迹。(E类)Frataxin与HSC20共定位。用Frataxin-HA和HSC20-Flag构建物转染COS7细胞。然后用单克隆抗Flag/羊抗鼠罗丹明（红色）和兔抗HA/羊抗兔荧光素结合物（绿色）对细胞进行免疫荧光分析。黄色的数字是两个数字的合并。(F类)铁增加了HSC20与frataxin的结合。用frataxin-HA和HSC20-Flag构建物转染HEK293T细胞，并用图中相应成分的HEPES缓冲液溶解/洗涤。细胞裂解物用抗-HA抗体免疫沉淀，用抗-Fag抗体和HA抗体免疫印迹。(G公司)Frataxin抑制HSC20的表达。HEK293T细胞接种在12孔板中，并转染相应数量的Frataxin-Flag或HSC20myc质粒。48小时后收集细胞，并用抗Flag和抗myc抗体进行检测。(H（H）)HSC20在frataxin缺乏细胞中表达增加。左三个面板：T265（施万细胞）、HeLa和HOG细胞转染50 n米干扰阴性对照siRNA或frataxin siRNA。右面板：分析FRDA患者（GM15850）及其健康兄弟（GM15851）的淋巴母细胞。(我)在线粒体通透性铁螯合剂DFP（25µ米). (J型)HSC20的过度表达可以克服由frataxin敲除引起的线粒体顺乌头酸酶活性的丧失。用相应的寡核苷酸转染HeLa细胞，并用乌头糖活性凝胶染色分析100µg蛋白质。
图4。
图4。
HSC20靶向线粒体(A类)HSC20在COS7细胞中与有丝分裂跟踪器共定位。用pcDNA-HSC20Flag（顶层）或pcDNA-del26HSC20Flag载体（底层）转染COS7细胞，并用单克隆抗Flag/山羊抗小鼠FITC（A和G，绿色）和Mitotrack（B和H，红色）进行免疫荧光分析。中间层：COS7细胞通过HSC20多抗体/山羊抗兔FITC（D，绿色）和Mitotrack（E，红色）进行分析。右栏中的黄色图片分别是左两张图片的合并。(B)HSC20位于线粒体；通道2，HeLa细胞的胞质裂解物；通道3，HeLa细胞的线粒体裂解物。用抗线粒体乌头酸酶、抗Nfs1、抗β-肌动蛋白、抗HSC20和抗细胞色素进行印迹-c（c）抗体。
图5。
图5。
HSC20与GRP75和Nfs1/ISCU复合体相互作用。(A类)HSC20与Nfs1/ISCU复合体相互作用。用pcDNA-HSC20-Flag、pXS-Nfs1-myc和pSX-ISCU-HA联合转染HEK293T细胞。用小鼠IgG或Flag抗体免疫沉淀细胞裂解物。用myc、Flag和HA抗体检测沉淀物。(B)铁增加了HSC20与ISCU的结合。HEK293T细胞用ISCU-HA和HSC20-Flag构建体转染，并用含有上图相应成分的HEPES缓冲液裂解/洗涤。细胞裂解物用抗-Flag抗体免疫沉淀，并用抗-Flag和HA抗体免疫印迹。(C类)HSC20与GRP75相互作用。用pcDNA-HSC20-myc和pcDNA-GRP75-Flag联合转染HEK293T细胞。用小鼠IgG或Flag抗体（左）或兔IgG和myc抗体免疫细胞裂解物。用Flag和HA抗体检测沉淀物。(D类)HSC20与Nfs1/ISCU复合体和GRP75共同本地化。顶层：将pcDNA-ISCU2HA和pcDNA-HSC20Flag联合转染COS7细胞；中间层：用pXS-Nfs1-myc和pcDNA-HSC20Flag转染COS7细胞；底层：用pcDNA-HSC20-myc和pcDNA-GRP75-Flag联合转染COS7细胞。然后用单克隆抗Flag/羊抗鼠罗丹明（红色）、兔抗HA（或myc）/羊抗兔荧光素结合物（绿色）对细胞进行免疫荧光分析。然后合并图像（黄色）。
图6。
图6。
沉默HSC20阻碍ISC生物发生并增加ROS。(A类)HSC20-1 siRNA-介导的敲除可降低过度表达的HSC20和内源性HSC20。左图：HEK293T细胞按上述方法转染相应的寡核苷酸，48小时后，用myc和actin抗体分析细胞裂解产物。右：HeLa细胞转染了两个圆形siRNA（50 n米)在第3天和第6天（从接种细胞之日起），收集细胞，进行裂解，并用HSC20抗体和肌动蛋白抗体分析细胞裂解产物。(B)HSC20 siRNA敲除降低细胞活力并抑制细胞增殖。(C类)HSC20敲除降低了ISC相关酶顺乌头酸酶和SDH的活性，但不降低非ISC相关酶类的活性。HeLa细胞转染50 n米对照siRNA或HSC20 siRNA，48小时后，用全细胞裂解物分析酶活性（乌头糖、苹果酸脱氢酶、柠檬酸合成酶）。对于琥珀酸脱氢酶，分离线粒体并用于酶分析。(D类)HSC20敲除降低线粒体和细胞溶质顺乌头酸酶活性。用对照siRNA、HSC20-1 siRNA或HSC20-2 siRNA转染HeLa细胞。48小时后，用100μg全细胞裂解物进行乌头糖酶活性凝胶分析。对条带的密度测定进行了分析，并显示在右侧。(E类)细胞溶质形式HSC20不能恢复HSC20敲除引起的细胞溶质顺乌头酸酶活性。将相应的siRNA和相应的质粒转染HeLa细胞（mut，pcDNA-HSC20Flag和pcDNA-del26HSC20Flag质粒均沉默突变，生成HSC20-1 siRNA耐药质粒）。48小时后，使用100μg全细胞裂解物进行乌头酸酶活性凝胶分析。(F类)HSC20缺失细胞中ISC生物发生的蛋白质组学变化。
图7。
图7。
HSC20和铁稳态。(A类). 四胱氨酸基序对HSC20的稳定性很重要。用等量的以下质粒转染HEK293T细胞：pcDNA-HSC20Flag、pcDNA-HSE C20-C41SC44S-Flag和pcDNA-HSE C20-C58SC61S-Flag。48小时后，裂解细胞，并用Flag抗体和MnSOD抗体分析40µg蛋白质。(B). 铁螯合降低了frataxin、HSC20和铁蛋白的表达。HeLa细胞在补充有100µ米DFO或100µg/ml FAC，并用相应抗体进行分析。(C类)转染对照siRNA或HSC20 siRNA的HeLa细胞的细胞铁浓度。实验重复至少三次*P（P）< 0.05, ***P（P）<0.001。(D类). HSC20敲除导致TfR1、FPN、IRP2增加，铁蛋白水平降低。(E类)对照细胞和HSC20-缺失细胞中的超氧化物生成。实验重复三次**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图8。
图8。
HSC20和frataxin在哺乳动物ISC生物发生中的可能功能模型，改编自参考文献（24）。Frataxin和HSC20分别以红色和蓝色突出显示。
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