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.2012年2月；32（4）:880-96。
doi:10.1128/MCB.06312-11。 Epub 2011年12月12日。

成年小鼠肝脏中STAT5和BCL6与生长激素调节基因的动态性别差异结合

张一静 1, 叶卡捷琳娜·拉兹, 大卫·J·瓦克斯曼
附属公司

成年小鼠肝脏中STAT5和BCL6与生长激素调节基因的动态性别差异结合

张一静等。 分子细胞生物学. 2012年2月.

摘要

性别依赖性垂体生长激素（GH）分泌模式决定了小鼠和大鼠肝脏中>1000个基因的性别偏见表达，影响脂质和药物代谢、炎症和疾病。一个基本的生物学问题是，仅仅基于GH输入信号模式，数百个性别偏见基因如何实现稳健的差异表达：男性GH脉冲刺激与女性GH近持续暴露。STAT5是GH在肝脏中的性别依赖性效应的一个重要转录介质，但其性别依赖性作用的机制尚不清楚。在这里，我们阐明了STAT5和GH/STAT5调节的阻遏物BCL6在全基因组范围内与小鼠肝脏染色质的动态、性别依赖性结合，揭示了这两种肝脏基因表达性别差异调节因子之间的相互作用。我们的发现在性别依赖的STAT5结合和性别偏见的靶基因表达之间建立了密切的相关性。此外，性别依赖性STAT5结合与性别偏见的DNA酶超敏反应、H3-K4me1和H3-K4me3（激活）标记呈正相关，与性别偏见H3-K27me3（抑制）标记呈负相关，与HNF6/CDP因子的性别差异富集基序相关。重要的是，BCL6结合优先与男性肝脏中女性成瘾STAT5靶点的抑制相关。此外，BCL6和STAT5共同靶点而非BCL6独特靶点显示出对脂质和药物代谢的强烈富集。这些发现为这两种GH调节转录因子建立和维持影响肝脏生理和疾病的性别差异的机制提供了一个全面的全基因组视角。这里用于表征性别依赖性STAT5和BCL6结合的方法可以应用于其他条件特异性调节因子和结合位点及其与协同染色质结合因子的相互作用。

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数字

图1
图1
雄性与雌性小鼠肝脏中STAT5结合的动态性质。（A） EMSA凝胶显示8只雄性和4只雌性小鼠肝脏的STAT5 DNA结合活性状态。单个肝脏中STAT5活性高（H）、低（L）或中等（Int）。STAT5活性在低活性雌性肝脏中显著高于背景值，但在低活性雄性肝脏中未检测到。右侧箭头表示STAT5 EMSA复合体。（B） 将雄性小鼠与GH持续输注7天，可消除未经治疗雄性小鼠肝脏STAT5活性的搏动性（间歇性），如图中所示的12个个体组和其他组雄性肝脏中没有STAT5无活性的雄性肝脏所示（数据未显示）。通常，随机选择的30至60%未经治疗的男性肝脏显示STAT5高或STAT5中等EMSA特征。如图所示，左侧的两条车道来自未经治疗的雄性，它们的STAT5活性分别为低活性和高活性。箭头，STAT5 EMSA复合体。（C） ChIP-Seq在4个指示肝脏组中确定的STAT5峰值数量，因性别和STAT5高活性与低活性状态而异。补充材料表S1中提供了详细的峰值列表。（D） UCSC基因组浏览器查看STAT5的分布情况免疫球蛋白1。带有5个红色箭头的轨迹表示由ChIP-PCR（17）识别的5个STAT5结合区域。其他轨迹标记肝脏DHS位点（39）、合并STAT5峰集中的STAT5峰值（见补充材料中的表S1F）以及从头开始-在本研究中发现了STAT5基序。底部的四个轨迹显示了四个指示组的STAT5 ChIP-Seq读数，显示为使用MACS软件生成的wig文件，滑动窗口平均值为100 bp，步长为20 bp。STAT5轨道归一化为STAT5-MH样本（参见补充材料中的图S1E）。
图2
图2
STAT5高和STAT5低肝脏中的STAT5结合位点和基序。（A） 显示STAT5-MH峰值数量的图表（9799个峰值按照x个轴按MACS峰值得分降序排列），与每一组100个连续峰值中的STAT5-ML峰值重叠，步长为1个峰值。（插图）比较STAT5-MH和STAT5-ML峰值集的维恩图，显示与STAT5-ML峰值集相同的STAT5-MHz峰值数量（“共同峰值”）以及每个峰值集特有的峰值数量。（B） 图表显示了在每一组连续的100个峰中与STAT5-FL峰重叠的STAT5-FH峰的数量（12753个STAT5-F峰沿着x个轴），按照面板A（插图）的描述进行分析。文恩图比较了STAT5-FH和STAT5-FL峰值集，指出了与STAT5-FL峰值集（共有峰值）相同的STAT5-F-H峰值数量以及每个峰值集唯一的数量。（C） 序列标志代表由从头开始模体发现应用于STAT5-MH峰（顶部）。此徽标与发现的徽标几乎相同从头开始来自STAT5-FH峰值集（数据未显示），并且与Transfac STAT5B矩阵徽标（底部）非常相似。（D） STAT5基序在STAT5-MH唯一峰和STAT5-ML唯一峰的顶点周围的分布以及两组峰的共有峰，如面板A中的维恩图所定义。（E）STAT5-FH唯一峰和TAT5-FL唯一峰以及两组共有峰的相应分布，如面板B中的维恩图所定义的。显示在年axis是每个60bp的连续窗口中的模体总数，步长为1bp，归一化为每个样本中的峰值总数。（F） 高质量STAT5 ChIP-Seq峰具有更多的STAT5基序。所示为每个峰中包含0、1、2、3或4次STAT5基序的STAT5-MH峰的数量，该数量是根据STAT5 ChIP-Seq MACS得分确定并分组的三个指示的STAT5-MH峰子集。STAT5-FH峰值产生了非常相似的模式（数据未显示）。
图3
图3
雄性富集和雌性富集的STAT5峰：与HNF6/CDP基序和表观遗传标记的关联。（A） 使用MAnorm进行归一化后，15094个合并STAT5峰值集合中STAT5-MH读数数量与STAT5-FH读数数量的M与A图（见补充材料中的表S1F）（见材料和方法）。每个峰值与M值和A值相关：M=log2[（STAT5-MH序列读取次数）/（STAT5-FH读取次数）；A=0.5×[log2（STAT5-MH读取次数）+日志2（STAT5-FH读取次数）]。使用>2的折叠变化作为截止值（|M值|，>1；一对水平黑线），我们识别出1765个STAT5-MH富集峰（蓝点）、1791个STAT5-FH富集峰（红点）和11538个常见峰（黑点）。STAT5峰的总数（15094）对应于STAT5-MH和STAT5-FH合并峰集（见材料和方法）。补充材料表S1F中显示了每个峰值的详细信息。（B和C）数量从头开始-在每一个连续的500个合并STAT5峰集合中发现的STAT5基序（B）和HNF6/CDP家族基序（C），根据雄性与雌性STAT5结合活性的比率进行排序，即高M值（雄性富集STAT5峰值）和低M值（雌性富集STAT6峰值）。M值标度沿上轴显示，STAT5峰值秩沿下轴显示，富集分数沿右轴显示。（D） DHS位点（红色）和H3-K27me3（蓝色）序列读取的性别比（log2与按M值排序的15094组合并STAT5峰的性别富集相比，如面板B和C。（E）H3-K4me1（绿色）、H3-K4me3（紫色）和H3-K9me3（蓝色）序列读取的性别比（对数2量表）与按M值排列的15094个合并STAT5峰的性别富集。（F） 基于面板D和E中显示的研究结果，模型描述了性别依赖性STAT5结合位点周围染色质可及性、H3-K27me3标记（黑旗）以及H3-K4me1和H3-K4me3标记（白旗）的性别差异；另请参见补充材料中的图S3D至F。性富集STAT5结合与基因表达状态（向前箭头）、染色质可及性、H3-K4me1和H3-K4me3标记呈正相关，与H3-K27me27标记呈负相关。然而，尽管女性富集STAT5结合位点的H3-K27me3标记水平稍高（对比补充材料中的图S3E和图F），男性肝脏中女性富集STAT_5结合位点显示的开放染色质比男性富集STAT5-结合位点更多（对比补充材料中的图S 3C和图D）。
图4
图4
性富集STAT5结合与垂体GH依赖性和性别偏见基因表达之间的关系。（A） 15094个合并的STAT5峰组（图3A）被映射到STAT5靶基因，定义为合并STAT5峰值10 kb内的RefSeq基因。15094个STAT5峰中，共有10617个（70%）映射到总共5076个基因，如维恩图所示，这些基因被分类为男性富集、女性富集或常见STAT5靶点。（B） 在雄性或雌性小鼠肝脏中，对垂体切除术（Hypox）反应的基因的A组中所示的3组STAT5靶点中的每一组都进行了富集。该图显示了男性和女性肝脏垂体切除术后基因表达的变化，该图基于微阵列数据（61）。数据以日志形式绘制2雄性垂体切除与未处理对照（UT；即假手术小鼠）的表达比率(x个轴）和内螺纹(年轴），用于通过微阵列显著性过滤器的基因P（P）< 0.001. 每个点代表一个基因，颜色表示其在未经处理的小鼠肝脏中的雌雄表达比率，如日志所示2-缩放右侧的颜色栏。所示为ESs和Fisher精确测试P（P）使用微阵列上表示的所有RefSeq基因作为背景，在每个象限的基因集合中，为面板A中的三个STAT5靶基因集合中的每一个计算值。蓝色字体表示富含STAT5-MH的靶点的ES值，棕色字体表示富含TAT5-FH的靶点ES值，黑色字体表示STAT5男性和女性常见靶点的ES值。STAT5靶基因的发现在除第一象限外的所有象限中显著富集，第一象限代表垂体切除术在男性和女性肝脏中诱导的基因，这与GH激活的STAT5主要是基因表达的正向调节器一致。（C） 垂体切除反应基因P（P）<0.001的水平在男性肝（左）和女性肝（右）中富含含有STAT5基序的STAT5靶点。使用其他切口来定义垂体切除反应基因，获得了几乎相同的结果（数据未显示）。（D） STAT5靶向的性别偏见RefSeq基因的分数，作为STAT5峰值到基因体距离的函数，用于将该基因识别为STAT5目标。（E） 共有2282个性别偏见RefSeq基因根据男性/女性表达比率进行了排名，如底部的颜色栏所示（log2比率）。对于面板A中显示的三组STAT5靶基因中的每一组，计算了400个性别偏见基因的每个连续组中存在的靶基因的比例。STAT5靶基因的频率随着表达性别偏见的增加而显著增加，尤其是女性特异性基因（右）。（F） 基因集富集分析显示，男性偏倚基因中富含STAT5-MH的靶点和女性偏倚的基因中富含TAT5-FH的靶点具有显著的NES（标准化富集分数）。这个x个axis代表安捷伦44K_v1微阵列平台上存在的所有21794个RefSeq基因，用于获得男性/女性表达比率（61）；这个年axis表示跑步强化分数。（G） 六组STAT5靶点中男性特异性和女性特异性基因的富集，这些靶点使用STAT5峰的六个子集进行鉴定，如标准化对数的指示范围所定义2公/母STAT5序列读数（M值），如补充材料图S4所示。
图5
图5
STAT5在性别特异基因上的性别偏见结合。所示为UCSC基因组浏览器屏幕截图，其中包含STAT5在雄性特异基因（A和B）处的雄性富集结合以及STAT5与雌性特异基因（C）处的雌性富集结合。每个面板显示了通过微阵列分析（61）确定的每个基因的性别特异性（男性/女性或女性/男性表达比率），水平黑条表示STAT5高活性男性（MH）和女性（FH）肝脏中发现的包含STAT5结合位点的染色体间隔。底部的四个轨迹显示了四个指示鼠标组的STAT5 ChIP-Seq读数，如图1D所示。
图6
图6
七类STAT5和BCL6结合位点：基序、靶点和性别特异性基因的富集。（A） 维恩图描述了通过比较基因组坐标确定的指示STAT5和BCL6-M峰组之间重叠的峰数（见补充材料中的表S1）。（B） 面板A（标记为I至VII）中维恩图定义的七种不同类别STAT5和BCL6结合位点的DNA序列标志（基序），由从头开始基序发现。利用以峰顶为中心的总宽度为600 nt的山峰进行了母题发现。如图所示，I类位点所示的基序与II类和III类位点的基序几乎相同，VI类位点所显示的基序也与V类位点的基序几乎相同（另请参见补充材料中的图S5B）。（C） 包含这两个基序的STAT5和BCL6共有峰组（即面板A中的IV、V和VI类）从BCL6基序到最近STAT5基序的距离的累积分布。（D） 描述所示STAT5和BCL6-M靶基因集重叠的基因靶数量的维恩图。该文氏图确定的目标基因集被指定为I至VII，对应于面板A中所示的七个峰值集。ES和Fisher精确检验P（P）值显示在每个条形图集的顶部。
图7
图7
BCL6在男性肝脏中与女性富集STAT5结合女性特异基因相关的位点的结合。所示为UCSC Browser的STAT5和BCL6与四个女性特异基因结合的屏幕截图，Cux2型,贝珀,Ntrk2号机组、和N纳米。（A和B）图5所示的STAT5结合的相同四条轨道，以及显示BCL6在雄性和雌性肝脏中结合的另外两条轨道，如每个轨道上方所标记的。（C和D）仅显示三条轨道的屏幕截图，水平条标记所示轨道的峰值区域，如MACS峰值呼叫软件所示。STAT5-ML、STAT5-FL和BCL6-F轨迹中的STAT5和BCL6结合水平明显低于此处所示水平（参见补充材料图S1E中的数据）。Cux2型（A） 属于STAT5/BCL6 V类，其他三个基因属于VI类（图6D；另见补充材料中的表S2C和D）。与STAT5-FH肝相比，STAT5-FL肝中的STAT5结合持续存在Cux2型（A） 和其他基因（见图S1E），而STAT5结合很少在STAT5-ML肝中持续存在，而STAT3-MH肝中很少持续存在。所示的雌性与雄性的表达比率通过微阵列分析确定（61），除了Cux2型经qPCR（35）检测。
图8
图8
7组STAT5和BCL6峰值靶点的转录因子基序（A）和基因本体（B）富集分析。（A） 显示所有图案ES值的热图(P（P）<1E−10；ES，>1.7）在图6A所示的7个峰集中至少1组中，使用所有小鼠肝脏DHS位点（39）中存在的基序作为背景，这些基序与STAT5-MH或STAT5-FH峰或BCL6-M峰没有重叠。用于富集分析的基序家族是前面描述的97个基序家族的集合（41），补充了材料和方法中描述的其他基序。（B） 热图显示GO项的ES值，满足ES>2.5和P（P）在图6D中定义的7个基因集中，每个基因列表中包含至少1个>8的基因的数量，以所有RefSeq基因为背景。补充材料的表S3中列出了丰富GO术语的7个基因组中的每个基因。深红色表示高度富集的GO项，白色表示不富集，蓝色表示所示基因集中GO项的耗尽，如右侧ES刻度颜色条所示。右侧的垂直粉色条描述了与BCL6和STAT5通用目标（IV至VI类）相关的GO术语。
图9
图9
STAT5、BCL6和具有HNF6/CDP基序的因子对性别特异性肝基因表达的调节模型。男性（搏动性）血浆GH和女性（近连续性）血浆GH激活肝脏STAT5活性的不同时间模式（男性的间歇性STAT5活动与女性的持续STAT5活）（图1A和B）。肝脏STAT5活性的这些性别差异模式分别与男性富集的STAT5在男性偏倚基因上的结合和女性富集的STAT_5在女性偏倚的基因上的绑定有关（图4）。转录抑制因子BCL6在雄性肝脏中更高表达，在那里它优先结合与雌性偏向基因相关的STAT5位点（图第6和第7段）；BCL6对STAT5结合的这种竞争被认为是通过抑制男性肝脏中雌性成虫基因的表达来增加肝脏性别差异。在女性肝脏中，女性血浆GH谱抑制BCL6号机组（43），男性肝脏中女性偏爱基因的抑制得到缓解。HNF6/CDP因子的结合位点基序优先与男性富集的STAT5结合位点相关（图3C），表明HNF6/CDP因子有助于男性偏倚基因的调控。这种调节的两种可能机制被阐明：（i）在男性肝脏中，一种HNF6/CDP因子，可能是HNF6（ONECUT1），与STAT5协同正向调节男性偏倚基因（上图）；（ii）在女性肝脏中，HNF6/CDP家族成员CUX2（CUTL2）是一种阻遏物（21），在女性而非男性肝脏中表达（35），与附近男性富集的STAT5结合位点结合并抑制男性偏倚基因的表达（下图）。
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