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.2011;6（11）：e27600。
doi:10.1371/journal.pone.0027600。 Epub 2011年11月16日。

父母接触环磷酰胺诱导第一次合子分裂期间功能性微核的形成

莉莎娜·格雷尼尔 1, 伯纳德·罗拜尔, 芭芭拉·福尔斯
附属公司

父母接触环磷酰胺诱导第一次合子分裂期间功能性微核的形成

莉莎娜·格雷尼尔等。 公共科学图书馆一号. 2011.

摘要

父亲接触癌症化疗药物或环境化学品可能会对植入前胚胎中表现出来的后代结果产生不利影响。本研究的目的是确定父亲接触环磷酰胺（一种抗癌烷基化剂）对卵裂期大鼠胚胎微核的形成、染色质来源和功能的影响。雄性Sprague-Dawley大鼠用生理盐水或环磷酰胺（6 mg/kg/天）灌胃4周，并与自然循环雌性交配，以收集原核受精卵和2-8个细胞胚胎。利用共焦显微镜对微核染色质结构进行了表征，以检测母体染色质标记H3K9me3和核膜标记层粘连蛋白B的免疫反应性。使用EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）掺入监测DNA合成。暴露于环磷酰胺的精子受精后，卵裂期胚胎的微核显著增加（对照胚胎：1%至5%；处理过的雄性繁殖的胚胎：70%）。微核的形成发生在第一次合子分裂期间，与随后的发育延迟有关。H3K9me3的缺失表明这些微核来源于父系。微核具有不完全的核周和核周层粘连B1膜形成，但将EdU并入DNA的程度与主核相同。由于父亲基因组受损而形成的微核可能在增加与辅助生殖技术的使用、癌症幸存者的亲子关系和父亲衰老相关的胚胎丢失率方面发挥作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。第一次合子分裂的体外时机。
（A） 在第1天0900至1030小时之间每隔15分钟通过光学显微镜评估达到2细胞期的受精卵比例。父亲接触CPA会延迟第一次合子分裂的时间，而不会影响他们的分裂能力。条形图表示每次重复的平均值±平均值的标准误差；控件位于孵化栏中，CPA父系胚胎位于黑色栏中。（B） 体外培养的CPA雄性胚胎经碘化丙啶染色后的免疫荧光图像为红色。在合子细胞周期的第一中期和末期可以看到染色质的滞后片段，在2个细胞胚胎中可以清楚地看到微核（MN）。MN是在CPA暴露精子受精的合子第一次合子分裂期间形成的。滞后染色质和MN以白色圈出。我们收集了SAL N = 5-8只雄性，76-97只胚胎和CPA N = 2-5只雄性，31-75个胚胎。数据通过Chi-square，Fisher Exact检验和Bonferroni校正进行统计分析**P（P）≤0.01, ***P（P）≤0.001.
图2
图2。早期细胞分裂期胚胎的体内进展。
在体内受精后（A）第1天1000小时收集早期细胞分裂胚胎；（B） 第2天1400小时；（C） 第3天1000小时。胚胎阶段是通过使用共聚焦显微镜计数细胞核和细胞的数量来确定的，分为发育阶段（参见图例），并报告为每次复制的平均百分比；误差条表示平均值的标准误差。在收集的第2天和第3天，父亲接触CPA会延迟早期卵裂阶段胚胎的发育。我们收集了：（A）第1天，SAL N = 8只雄性，115只2细胞胚胎，CPA N = 雄性5只，2细胞胚胎56只；（B） 第2天，SAL N = 4只雄性，43只胚胎，CPA N = 雄性3只，胚胎36枚；（C） 第3天，SAL N = 8只雄性，135只胚胎，CPA N = 8只雄性，120个胚胎。数据采用Chi-square、Fisher精确检验进行统计分析*P（P）≤0.05, ***P（P）≤0.001.
图3
图3。细胞分裂胚胎中微核的发生率。
（A） 细胞分裂胚胎中微核（MN）的发生率。（B） 与对照组相比，父亲暴露于CPA显著增加了早期细胞分裂胚胎中MN的发病率，平均每个胚胎2–3 MN。C） MN在含有至少2 MN的2个细胞胚胎中第一次合子分裂后的分布。在第一次合卵分裂期间，父系接触CPA诱导的MN随机分布到两个细胞中。（D） MN的发病率和（E）CPA处理雄性后代第3天胚胎中每个胚胎细胞MN的平均数。与正常分裂的5-8c胚胎和快速分裂的9-16c胚胎相比，延迟3-4c胚胎中MN的发生率和每个细胞MN的数量显著增加。折线图是每次重复的平均值，误差条是平均值的标准误差；灰色线代表SAL和黑色线CPA父系胚胎。我们收集了：第1天SAL N = 8只雄性，115个2细胞胚胎，CPA N = 雄性5只，细胞胚胎562枚；第3天SAL N = 8只雄性，135只胚胎，CPA N = 8只雄性，120只胚胎。分别采用卡方Fisher精确检验和Kruskal-Wallis分析MN的发病率和平均MN数*P（P）≤0.05, ***P（P）≤0.001.
图4
图4。早期卵裂期胚胎的核和微核（MN）染色质致密化。
（A） 早期卵裂期对照和CPA父系胚胎中的细胞核体积，以及CPA父系胚胎中收集第1天和第3天MN与细胞核体积的相对比率（B）。父亲接触CPA不会影响早期细胞分裂期胚胎的瞬时核体积变化，CPA诱导的MN体积在收集的第1天和第3天与主核相当。折线图表示每次重复的平均值，误差条表示平均值的标准误差；带菱形符号的灰色线表示控制，带方框的黑色线表示CPA后代胚胎。（C） 用碘化丙啶红染MN的CPA胚胎的免疫荧光图像，比较不同有丝分裂期同一胚胎细胞内MN和细胞核的染色质致密性。在同一细胞内，MN和核染色质在有丝分裂期间浓缩，在间期解聚，表明存在通讯。箭头指向去凝聚的MN染色质，而凝聚的MN染色质用白色圈起来。我们收集了：第0.5天SAL N = 6只雄性，109只胚胎，CPA N = 雄性5只，胚胎84枚；第1天SAL N = 8只雄性，115个胚胎，CPA N = 雄性5只，胚胎64枚；第3天SAL N = 8只雄性，129只胚胎，CPA N = 8只雄性，120只。进行带有Bonferroni校正的Kruskal-Wallis检验以进行统计分析*P（P）≤0.05, **P（P）≤0.01.
图5
图5。CPA暴露男性受精的早期细胞分裂胚胎中微核染色质的父母起源。
对原核合子和2个细胞胚进行染色，以检测母体表观染色质特异性标记H3K9me3（绿色）、DNA（用红色碘化丙啶复染），合并图像为黄色。顶部面板是控制面板，底部面板是CPA父系胚胎。合子中只有雌性原核和极体被H3K9me3染色；在2个细胞胚胎中，每个细胞核的一半用H3K9me3染色，代表女性来源的染色质。父系CPA处理不影响该亲本染色质标记。CPA父系胚胎MN中H3K9me3的缺失表明这些MN起源于2细胞胚胎的父系染色质。用共聚焦显微镜获取免疫荧光图像。箭头指向雌性（F）和雄性（M）原核，MN用白色圆圈表示，白色虚线表示2个细胞胚胎中的雌性（H3K9me3的阳性信号）与雄性（H3K9me3为阴性信号）染色质；在CPA繁殖的2细胞胚胎的右侧显示了MN的放大图像。我们收集了SAL和CPA，N = 每组2–3只雄性，每组15–30个胚胎，每个胚胎细胞分裂阶段用于定性分析。
图6
图6。CPA暴露精子受精的早期细胞分裂胚胎的微核膜特征。
在第0.5天、第1天和第3天收集原核合子和2细胞和8细胞CPA父系胚胎，并对核膜层粘连蛋白B1（绿色）、DNA（碘化丙啶，红色）进行染色，合并图像为黄色。我们分别在早期2细胞胚胎和8细胞胚胎中观察到层粘连B1的核-核周膜重新分布；这不受父亲CPA治疗的影响。CPA父系胚胎中的MN在两个胚胎采集时间点都显示出不完整的核膜和核仁周围膜的形成。这些图像是用共焦显微镜采集的。箭头指向雌性（F）和雄性（M）原核，MN用白色圈起来，每个胚胎期的左侧都有放大的图像。我们收集了N = SAL和CPA的每个胚胎细胞分裂阶段，每组2–3只雄性，15–30只胚胎，用于定性分析。
图7
图7。CPA父系胚胎微核中的DNA复制。
胚胎的免疫荧光图像用EdU Click-it（绿色）和DNA（红色碘化丙啶）染色，合并图像用黄色。MN用白色圆圈，箭头指向极体（PB）（EdU的内部阴性对照）。（A） 顶部面板：过夜在体外第一次合子分裂期间的孵化；底部面板：3小时在体外用EdU培养第3天胚胎，以评估早期细胞分裂胚胎中的DNA复制。父亲接触CPA不会影响早期细胞分裂胚胎中结合EdU的细胞比例。（B） 比较CPA暴露雄性后代第1天和第3天胚胎中相对于DNA含量的EdU掺入MN与细胞核比率。我们观察到MN合成DNA的程度与2细胞胚和8细胞胚的细胞核相同。（C） 比较CPA暴露雄性后代第1天和第3天胚胎中EdU阳性MN在EdU阳性细胞中的比例。与2个细胞胚胎相比，8个细胞胚胎中含有EdU的功能性MN比例下降。条形图是每个重复的平均比率或比例；误差条表示平均值的标准误差。我们在SAL N第1天收集 = 6只雄性，93只胚胎 = 5只雄性，29只胚胎，第3天SAL N = 5只雄性，55只胚胎CPA N = 6只雄性，73只胚胎。比率比较由Kruskal-Wallis进行统计分析，胚胎比例由卡方检验、Fisher精确检验和：***P（P）≤0.001.
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