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.2011年12月；89(6):562-77.
doi:10.1139/o11-063。

低氧通过多种信号通路通过金属应答转录因子-1（MTF-1）诱导金属硫蛋白反式激活

安妮·杜贝 1, Jean-François Harrisson女士, 吉纳维耶夫·圣格莱斯, 卡尔·塞根
附属机构

低氧通过多种信号通路通过金属应答转录因子-1（MTF-1）诱导金属硫蛋白反式激活

安妮·杜贝等。 生物化学细胞生物学. 2011年12月.

摘要

金属应答转录因子-1（MTF-1）对于金属和缺氧诱导编码金属硫蛋白的基因至关重要。在这里，我们研究了低氧对MTF-1激活的控制机制。Mt基因转录的低氧激活依赖于Mt基因启动子中金属调节元件（MREs）的存在。我们发现MREa和MREd是控制小鼠Mt-1基因缺氧诱导的主要因素。在Mtf-1缺失细胞中的转染实验表明，Mtf-1对缺氧诱导至关重要。染色质免疫沉淀分析表明，MTF-1与DNA的结合活性在锌的存在下显著增强，但在缺氧条件下没有增强。值得注意的是，缺氧诱导因子-（HIF）1α被募集到Mt-1启动子，以响应缺氧，但不响应锌。PKC、JNK和PI3K抑制剂以及电子传递链抑制剂鱼藤酮和粘液噻唑均抑制MTF-1的激活，但抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸则不抑制。我们发现脯氨酰羟化酶抑制剂可以激活MTF-1，但这种激活需要HIF-1α的存在。最后，在MTF-1存在的情况下，HIF依赖性转录增强，并且HIF-1α刺激MRE启动子的诱导，从而表明这两个因素之间的合作。然而，共免疫沉淀实验并未表明MTF-1和HIF-1α之间存在直接的相互作用。

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数字

图1
图1
Northern印迹分析Mt-1型mRNA在不同细胞系暴露于金属或缺氧中。（A） 人HepG2和小鼠NIH 3T3，C2C类12，L细胞未经处理，用100μmol/L ZnCl处理2或暴露于缺氧（pO2=1%）。对RNA进行电泳，转移到Hybond-N膜上，并与32P标记cDNA编码小鼠Mt-1型膜被剥离，并用一个与18S核糖体RNA相对应的寡核苷酸重新杂交。北部数据通过磷光成像仪分析和Mt-1型：计算18S比率。结果显示为在常压下保存的未处理细胞在基础水平上的折叠诱导，并表示3个不同实验的平均值±SD。（B） 小鼠L细胞和野生型Mtf-1型-小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）（MTF-1）+/+和MTF-1−/−)未经处理，用2.5μmol/L CdCl处理2或暴露于缺氧（pO2=1%）持续16小时，如图所示，然后按照（A）所述分离总RNA。数据代表了3个单独的实验。（C） 图1B中代表性样品的Northern印迹。对照样品和处理样品之间的显著差异基于单样品单面（A）或学生t吨测试（B）.*，P（P）< 0.05; 和**，P（P）< 0.01.
图2
图2
鼠标的映射Mt-1型参与缺氧转录反应的启动子元件。（A） 近端启动子、缺失突变体和Mt-1型-此分析中使用的派生LUC构造。5种金属调节元件（MRE）（实心矩形）、E-box 1（USF）、USF/ARE元件、转录因子Sp1和NF1的结合位点以及TATA盒的排列。每个结构左端的数字表示相对于转录起点的位置。（B） 用所示质粒构建物和pTK-rLUC作为内标物转染小鼠L细胞，饥饿血清，并用100μmol/L ZnCl处理或不处理2或暴露于缺氧（pO2=1%），持续16 h。制备细胞提取物，并使用双LUC试剂盒测量LUC活性。报告者诱导被计算为基础水平上的折叠诱导。（C） 如图2B所述，用质粒混合物转染L细胞，质粒混合物包括报告野生型MT1-LUC或MREa突变报告质粒ΔMREa-LUC（ΔMREa）、ΔMREd-LUC，ΔMREa/d-LUC。结果表示为萤火虫LUC（fLUC）活性相对于肾小球LUC（rLUC）结构所指示水平的百分比。在（B）和（C）中，数据表示三次实验的平均值±SD。对照样品和处理样品之间或不同突变体之间的显著差异基于单样本单面（B）或学生的t吨测试（C）.*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; 和NS，不显著。
图3
图3
GF109203X、LY294002和SP600125对（MREd）的影响6-LUC表达式。C类2C类12用（MREa）混合物转染的细胞6-将LUC和pTK-rLUC进行血清饥饿处理，并单独与载体（0）或增加GF109203X（0至10μmol/L）、LY294002（0至100μmol/L）或SP600125（0至25μmol/L）的浓度预培养45分钟，如图所示，然后不进行处理，用50μmol/LZnCl处理2或暴露于缺氧（pO2=1%），持续16 h，然后测量LUC活性，如图2B所示。结果表示三次独立实验的平均值±SD。对照样品和处理样品之间的显著差异基于学生的t吨测试*，P（P）< 0.05.
图4
图4
2种线粒体电子传递抑制剂（鱼藤酮和粘噻唑）对（MREd）的影响6-LUC表达式。用pTK-rLUC和（a）3HRE-LUC或（B）（MREa）的混合物转染L细胞6-LUC是血清饥饿的，然后用鱼藤酮（Rot，100 ng/mL）或粘噻唑（Myx，50 ng/mL）处理或不处理（0），如所示，然后暴露或不暴露（对照）于缺氧（pO2=1%），持续16 h，然后测量LUC活性，如图2B所示。柱上的数字表示对照细胞在基础水平上的折叠诱导。结果表示一式三份进行的3个独立实验的平均值±标准差。对照样品和处理样品之间的显著差异基于学生的t吨测试**，P（P）< 0.01.
图5
图5
DMOG、EDHB和其他低氧药物对（MREd）的影响6-LUC表达式。（A） C类2C类12用pTK-rLUC和3HRE-LUC或（MREd）混合物转染的细胞6-LUC被血清饥饿，然后未经治疗（0），用DMOG（DM，1 mmol/L）、DFO（100μmol/L）、CoCl处理2（300μmol/L），氯化镍2（500μmol/L），氯化锌2（100μmol/L），或暴露于缺氧（Hx，pO2=1%），如图2B所示，在测量LUC活性前16小时。（B） 用pTK-rLUC和3HRE-LUC或（MREd）混合物转染L细胞6-如图所示，LUC被血清饥饿，然后未经治疗（0），接受EDHB治疗（ED；500μmol/L），或暴露于缺氧（Hx，pO）2=1%），如图2B所示，在测量LUC活性前16小时。结果表示三次独立实验的平均值±SD。对照样品和处理样品之间的显著差异基于学生的t吨测试*，P（P）< 0.05; 和**，P（P）< 0.01.
图6
图6
MTF-1或HIF-1α缺失对3HRE-LUC和（MREd）活性的影响6-LUC表达式。（A）Hif-1型用3HRE-LUC（左面板）或（MREd）混合物转染α-空和野生型小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）6-LUC（右面板）和pTK-rLUC，然后未暴露（对照）或暴露于缺氧（pO2=1%），持续16 h，然后测量LUC活性，如图2B所示。结果表示三次独立实验的平均值±SD。（B）Mtf-1型-用含有3HRE-LUC的质粒混合物转染无效突变MEF（左面板），（MREd）6-如下图所示，LUC（右侧面板）、pTK-LUC和100 ng人MTF-1表达质粒（pcMTF-1a）或空载体（pCi）。细胞培养24 h，然后用50μmol/L ZnCl处理或不处理（对照）2或暴露于缺氧（pO2=1%）持续16 h，如图2B所示，然后测量LUC活性。数据表示一式三份进行的3个独立实验的平均值±标准差。（C）Hif-1型用（MREd）混合物转染αnull和野生型MEF6-LUC、MT1-LUC或3HRE-LUC（如图所示）和pTK-rLUC，然后用500μmol/L EDHB处理或不处理（对照）或暴露于缺氧（pO2=1%）16小时，然后测量LUC活性，如图2B所示。结果表示三次独立实验的平均值±SD。对照样品和处理样品之间的显著差异基于学生的t吨测试*，P（P）< 0.05; 和**，P（P）< 0.01.
图7
图7
缺氧诱导HIF-1α和MTF-1的免疫印迹分析。L细胞未暴露（0，对照）或暴露于氯化锌2（锌，100μmol/L），氯化镍2（镍，500μmol/L），氯化钴2（Co，300μmol/L）、EDHB（E，500μmol/L）或缺氧（Hx，pO2=1%）持续16 h，制备全细胞裂解物，并用HIF-1α和MTF-1抗体以及微管蛋白（用作负荷对照）进行免疫印迹分析。所示结果代表了3个独立实验。Mtf-1型−/−，对照提取物Mtf-1型-空单元格。
图8
图8
锌和缺氧对MTF-1核定位和DNA结合的影响。（A） C类2C类12用100μmol/L ZnCl处理细胞（对照）2或暴露于缺氧（pO2=1%）持续16小时，如图所示。使用标记的MRE-s寡核苷酸通过电泳迁移率变化分析（EMSA）分析提取物。仅显示了含有特定MTF-1复合物的凝胶区域。（B） 免疫印迹法检测全细胞（WCE）、细胞核和细胞溶质提取物中的MTF-1。从未经处理的L细胞（0）中制备提取物，用100μmol/L ZnCl处理2（Zn），或暴露于缺氧（Hx）（pO2=1%），并用MTF-1和微管蛋白抗体进行免疫印迹分析。由于微管蛋白不是核提取物的一种合适的负荷控制，因此，通过氨基黑染色在印迹上检测到一条特殊的带。面板A和B中显示的结果代表了3个独立实验。（C） 使用从未经处理或用100μmol/L ZnCl处理的L细胞中分离的染色质进行ChIP分析2甲醛交联前，暴露3小时或缺氧16小时。如图所示，用MTF-1（抗MTF-1）或HIF-1α（抗HIF1α）抗体或免疫前正常兔血清（PI）进行交联染色质的免疫沉淀。用小鼠引物对PCR扩增IP输入（免疫沉淀前）和IP结合组分的DNAMt-1型或谷蛋白-1发起人。免疫沉淀前DNA的输入、扩增。输入样品含有0.4%用于交联MTF-1免疫沉淀的上清液。通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析。这些ChIP分析使用3种不同的染色质制剂进行了3次，结果相似。
图9
图9
小鼠MTF-1、HIF-1α和HIF-1β的协同免疫沉淀。L细胞未经处理（0），或用氯化锌处理2（锌，100μmol/L），氯化镍2（镍，500μmol/L），氯化钴2（Co，300μmol/L）培养3h，或在缺氧（Hx，pO）条件下培养2如实验程序（A）或Murphy等人（2008）（B）所述，制备全细胞提取物并免疫沉淀（IP），使用MTF-1或HIF-1α抗体，然后进行MTF-1、HIF-1β免疫沉淀的Western blot分析。电影曝光时间短或长；长时间接触后，HIF-1α免疫沉淀物中出现非特异性条带迁移，Mr略小于MTF-1α（MTF-1-l区，IP-HIF-1α区）。与该非特异性条带相关的蛋白也在其中一个对照提取物（IP-HIF-1α，通道0）中免疫沉淀。暴露时间如下：（A）s=1s，l=1min，HIF-1β=3min；和（B）s=3分钟，l=10分钟，HIF-1β=10分钟。
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