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.2012年1月；8(1):18-28.
doi:10.4161/auto.8.1.18077。 Epub 2012年1月1日。

DRAM-1编码调节自噬的多种亚型

李延马 1, 吉姆·奥普雷, 爱丽丝·D·鲍多, 阿特杰·霍克斯特拉, 凯文·M·瑞恩
附属公司

DRAM-1编码调节自噬的多种亚型

李延马等。 自噬. 2012年1月.

摘要

宏（自噬）是一种细胞机制，将细胞质成分输送到溶酶体进行降解。由于其在维持细胞完整性方面的作用，自噬可以预防各种疾病，包括癌症。p53是一个主要的抑癌基因，能正向和负向调节自噬。p53通过损伤调节自噬调节剂（DRAM-1）的转录激活诱导自噬。我们在此报道，DRAM-1不仅编码一种mRNA，还编码一系列p53诱导的剪接变体，这些变体在多种人类和小鼠细胞系中以不同水平表达。其中两个新的剪接变异体，称为SV4和SV5，产生成熟的mRNA物种。与“全长”DRAM-1（SV1）不同，SV4和SV5不定位于溶酶体或内体，而是分别部分定位于过氧化物酶体和自噬体。此外，SV4和SV5也可以与内质网的某些标记物共存。与SV1类似，SV4和SV5似乎不是程序性细胞死亡的诱导物，但它们确实调节自噬。总之，这些发现确定了新的自噬调控因子，为p53下游自噬的控制提供了见解。

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数字

图1
图1
DRAM-1剪接变异体由p53诱导。（A） 用1µg/ml多西环素处理Tet-on p53 Saos-2细胞24小时。然后收集RNA并在3%琼脂糖凝胶上进行分析。（B） western-blotting证实强力霉素对p53的诱导作用。（C） 包含不同内部外显子缺失的（A）剪接变异体的示意图。所显示的图像代表了在至少三个单独的实验中观察到的结果。
图2
图2
DRAM-1剪接变异体在多个人类和小鼠细胞中表达。（A） 用DRAM-1外显子1和外显子7的引物对一组人类细胞系的RNA进行半定量RT-PCR。用1µg/ml多西环素诱导p53诱导的Saos-2细胞中的p53诱导24小时分别用人和小鼠DRAM-1外显子1和外显子7的引物进行半定量RT-PCR。用1µg/ml多西环素在p53诱导的Saos-2细胞中诱导p53表达24小时。所示图像代表了至少三个单独实验中观察到的结果。
图3
图3
DRAM-1亚型1、4和5不诱导细胞死亡。（A和B）Saos-2细胞感染空腺病毒载体、DRAM-1亚型1、4或5或p53（阳性对照）。48小时后，收获粘附细胞和漂浮细胞，并通过流式细胞术测量亚G细胞百分比的细胞死亡程度1DNA含量。所示数据来自三个独立的实验，误差条表示标准偏差（s.d.）（B）。p53和DRAM-1亚型的蛋白表达通过western blotting（A）进行验证。Saos2细胞感染空腺病毒载体DRAM-1亚型1、4、5或p53。48 h后，用annexinV-Alexa Fluor 488和PI染色检测细胞凋亡，并用显微镜进行分析（C）。每个直方图表示Annexin-V阳性和PI阴性细胞或Annexin V阳性细胞和PI阳性细胞的平均百分比。结果是七次测定的平均值±标准差（d）。线粒体电位（ΔΨm）的测量采用MitoTracker Green FM进行评估，该FM可对线粒体进行染色，而不考虑Δψm和TMRE，TMRE仅由活性线粒体隔离。染色通过显微镜进行分析。每个直方图表示MitoTracker Green和TMRE阳性细胞的平均百分比。结果是四次测定的平均值±标准偏差（E）。用10µg DRAM-1 SV1、SV4或SV5、p53（阳性对照）或空质粒（pCMV；阴性对照）转染Saos-2细胞。48小时后，用含有G418的新鲜培养基替换转染细胞群，并在两周后评估克隆存活率（F）。所示图像代表了至少三个独立实验。
图4
图4
DRAM-1亚型1、4或5不能挽救由肿瘤细胞完全丧失德拉姆-1表达式。DRAM-1（随机存取存储器-1）飞行/飞行表达他莫昔芬诱导的腺病毒癌蛋白E1A-ER的MEF感染DRAM-1亚型1、4和5或空的逆转录病毒载体。通过western blot（A）验证DRAM-1 SV1、4和5的表达。然后，将这些细胞板感染Cre逆转录病毒以诱导重组，并在指定的地方使用空载体（-Cre）。通过RT-PCR（B）在消息级别验证DRAM-1删除。用500 nM的4-羟基三苯氧胺处理MEF 8小时，以激活该系统中的E1a。然后用0.2µg/ml阿霉素处理细胞。24小时后，收集粘附细胞和漂浮细胞，并通过流式细胞术测量细胞死亡程度，以了解亚G细胞的百分比1DNA含量。这些数据代表了在三个独立实验中观察到的结果，误差线表示标准偏差（C）。Tam，4-羟基三苯氧胺。
图5
图5
DRAM-1亚型1位于溶酶体以及早期和晚期内体，而非亚型4和5。用等量的DRAM-1腺病毒裂解物感染Saos-2细胞48小时。用共聚焦显微镜检测myc标记的DRAM1（红色）与相应溶酶体和内体蛋白组织蛋白酶D（A）、CD63（B）EEA1（C）（绿色）的共聚焦（黄色）。所示比例尺代表20µm。
图6
图6
DRAM-1亚型1和5被自噬体/自溶体的标记物部分定位。用携带mCherry-LC3转基因（A）和DRAM-1亚型1、4或5的腺病毒感染Saos-2细胞48小时。用共焦显微镜检测myc标记的DRAM-1（绿色）与LC3（红色）的显色（黄色）。（B） 在感染DRAM-1亚型（红色）48小时之前，用X-fect（Clontech）在Saos-2细胞中转染pEGFP-DFCP1（绿色），然后收获用于免疫荧光研究。所示比例尺代表20µm。
图7
图7
DRAM-1亚型4和5部分定位于内质网。用等量的DRAM-1腺病毒裂解物感染Saos-2细胞48小时。共聚焦显微镜检测myc标记的DRAM1（红色）与相应内质网蛋白Bip（A）和Calnexin（B）（绿色）的共聚焦（黄色）。所示比例尺代表20µm。
图8
图8
DRAM-1亚型4部分定位于过氧化物酶体。用等量的DRAM-1腺病毒裂解物感染Saos-2细胞48小时。用共聚焦显微镜检测myc标记的DRAM1（红色）与过氧化物酶体蛋白PMP70（A）和过氧化物酶-GFP（B）（绿色）的共聚焦（黄色）。所示比例尺代表20µm。
图9
图9
DRAM-1亚型表达诱导自噬体形成。（A） Saos-2细胞与GFP-LC3和DRAM-1亚型或空载体共同感染48小时。通过western blotting验证DRAM-1的蛋白表达。（B） 过度表达DRAM-1亚型的细胞的代表性图像显示自噬体的形成。所示比例尺代表20µm。（C） 自噬体形成定量。具有8个或8个以上GFP-LC3点的细胞被评分为具有累积自噬体的细胞阳性。在每种情况下，至少统计了200个单元格，误差栏指示标准偏差。（D） 以表达DRAM-1亚型1、4、5或“空”病毒的腺病毒感染Saos-2细胞作为对照。细胞裂解产物通过western blotting分析LC3、DRAM（myc）和肌动蛋白。所示数据代表了至少三个单独实验中观察到的结果。
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