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.2012年3月1日；21(5):978-90.
doi:10.1093/hmg/ddr529。 Epub 2011年11月11日。

线粒体DNA突变细胞的线粒体自噬是跨膜电位丧失和mTORC1抑制协同作用的结果

罗伯特·吉尔克森 1, 罗莎·拉·德弗里斯, 保罗·勒博特, 雅各布·D·威克斯特罗姆, 埃迪娜·托尔盖克斯, Orian S Shirihai公司, 谢尔盖·普雷德博斯基, 埃里克·肖恩
附属公司

线粒体DNA突变细胞的线粒体自噬是跨膜电位丧失和mTORC1抑制协同作用的结果

罗伯特·吉尔克森等。 人类分子遗传学. .

摘要

自噬已成为细胞器质量控制的一个关键细胞过程，但这一途径显然无法消除各种人类疾病患者线粒体DNA（mtDNA）中含有致病性突变的线粒体。为了探讨mtDNA介导的线粒体功能障碍如何与内源性自噬途径相互作用，我们检测了一组携带多种致病性mtDNA突变的人类细胞质杂交（cybrid）细胞系中的自噬状态。我们发现，遗传和化学诱导的线粒体跨膜电位（Δψ（m））损失都会导致前线粒体因子Parkin向线粒体募集。然而，令人惊讶的是，仅Δψ（m）的损失不足以促使线粒体向自噬体传递（线粒体吞噬）。我们发现，在携带mtDNA大规模部分缺失或mtDNA完全缺失的杂交后代中，用mTORC1抑制剂雷帕霉素处理后，可以诱导有丝分裂。此外，我们发现内源性Parkin水平是有丝分裂的关键决定因素。这些结果表明了一个双命中模型，在该模型中，（i）Δψ（m）丢失后Parkin的线粒体募集和（ii）mTORC1控制的一般大自噬都需要协同诱导，才能进行有丝分裂。似乎有丝分裂可以通过内源性自噬机制完成，但需要这两条途径的充分参与。

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数字

图1。
图1。
杂交细胞系的自噬状态。(A类)用抗GFP探针对总蛋白（每车道20µg）进行Western blot分析(n个= 4); 下部面板显示抗微管蛋白加载控制。(B类)使用ImageJ定量抗GFP蛋白印迹的条带。结合自噬LC3-GFP-II和游离GFP带的带强度，并表示为与细胞溶质LC3-GFP I的比率（平均值n个=4±SD）。星号表示与未经处理的细胞不同(P（P）<0.001，纽曼-基尔斯事后（post-hoc）双向重复测量方差分析后的测试）。(C类)LC3-GFP感染的WT和Δcybrid细胞系固定细胞的共焦荧光显微镜观察米雷帕霉素48小时(n个= 4). 比例尺=20µm。(天)每细胞LC3-GFP自噬体点状体平均数量和LC3-GFP-自噬体点状体平均大小的定量（平均值n个=4±SD）。星号表示与未经处理的细胞系不同(P（P）=0.034，纽曼-基尔斯事后（post-hoc）双向重复测量方差分析后的测试）。
图2。
图2。
WT和Δ细胞线粒体和自噬体的共焦显微镜观察。(A类)在没有或存在250 n的条件下培养的WT和Δ杂交细胞系米雷帕霉素48小时，然后用MitoTracker红（MTR）染色(n个= 4). 比例尺=20µm。注意线粒体与LC3-GFP阳性自噬体的共定位（箭头）。(B类)线粒体与LC3-GFP斑点共定位的定量（平均值n个=4±SD）。星号表示与所有其他细胞系的差异(P（P）=0.005，纽曼-基尔斯事后（post-hoc）双向重复测量方差分析后的测试）。
图3。
图3。
线粒体自噬中Parkin和p62的共焦荧光显微镜。(A类)用GFP-Parkin瞬时转染WT和Δ细胞，在没有或存在雷帕霉素的情况下生长，并用MitoTracker红染色(n个= 2). 比例尺=20µm。(B类)WT和Δ细胞在没有或存在雷帕霉素的情况下生长，用抗p62抗体进行免疫标记，并用MitoTracker红染色。注意，p62向肿胀的大线粒体（箭头）募集(n个= 2). (C类)在没有或存在雷帕霉素的情况下生长并用抗p62抗体进行免疫标记的LC3-GFP感染的WT和Δ细胞的共焦荧光显微镜(n个= 2). 比例尺=20µm。
图4。
图4。
杂交细胞系线粒体跨膜电位分析。(A类)杂交细胞系的平均TMRE荧光峰值（平均值n个=3±SD）。每个实验的荧光峰值均归一化为未染色细胞。星号表示与WT的差异(P（P）<0.001，邓内特事后（post-hoc）单向方差分析后的测试）。(B类)2.5 n孵育杂交细胞的代表性流式细胞术实验米TMRE公司。每个细胞系共有50000个事件。直方图(Y（Y）-轴）表示为处于最大值的细胞的%。(C类)2.5 n孵育的杂交细胞系的活细胞荧光显微镜米TMRE公司。注意Δ细胞的低TMRE荧光。比例尺=20µm。
图5。
图5。
自噬和mTORC1信号。(A类)对WT细胞（20µg）的裂解物进行Western blot分析，该细胞在CCCP浓度增加的情况下孵育1 h，并用抗GFP、抗磷S6和抗管蛋白抗体进行探测(n个= 2). (B类)在不存在或存在250N的情况下孵育的cybridge细胞系的裂解物的蛋白质印迹分析米雷帕霉素48h，用抗磷酸S6和抗微管蛋白抗体检测(n个= 2).
图6。
图6。
CCCP介导的解偶联和自噬。(A类)顶部，实验示意图。在没有或存在10µ的情况下生长的WT细胞的共焦荧光显微镜米CCCP 1 h，不使用或使用雷帕霉素预处理48 h；(n个= 3). 尺寸棒=20µm。(B类)定量A细胞中每个细胞LC3-GFP自噬小点的平均数量和LC3-GFP-自噬大点的平均大小（平均值n个=3±SD）。图1中的Δ电池数据。(C类)顶部，实验示意图。在没有或存在10µ的情况下生长的WT细胞的共焦荧光显微镜米CCCP 49小时，在没有或存在雷帕霉素的情况下48小时(n个= 3). (天)定量如（B）所示；(n个= 3).
图7。
图7。
(A类)粉红色1和帕金杂交细胞系中的mRNA。内生水平的qRT-PCR分析粉红色1（灰色）和帕金杂交细胞系中的（黑色）转录物n个=3±SD）。星号表示与WT的差异(P（P）<0.05，Dunnett事后（post-hoc）单向方差分析后的测试）。(B类)杂交细胞系中Parkin的招募。指示细胞系瞬时转染GFP-Parkin，并对其向线粒体补充Parkin进行评分(补充材料，图S4C)在不存在或存在10µ米CCCP。星号表示与未经处理的细胞不同(P（P）<0.001，纽曼-基尔斯事后（post-hoc）双向重复测量方差分析后的测试；n个=3）。(C类)表达LC3-GFP的WT、Δ和ρ0细胞与雷帕霉素孵育48小时。下部面板显示细胞瞬时转染了mCherry-Parkin，并提供了三个独立实验的代表性说明。星号表示表达mCherry-Parkin的细胞（图中未显示）。尺寸棒=20µm。(天)LC3-GFP点刺数和每个细胞点刺大小的定量，如图1D、6B和D所示。n个=3个实验。星号表示与未转染细胞的差异(P（P）=0.031，纽曼-基尔斯事后（post-hoc）双向重复测量方差分析后的测试）。(E类)表达LC3-GFPρ0用mCherry-Parkin（红色）瞬时转染细胞，用雷帕霉素孵育48小时，然后用MitoTracker DeepRed（蓝色）染色。插图：注意所有三个信号的同位化。比例尺=20µm。
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