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.2011;6(11):E27 084.
DOI:101371/波恩0027084。 EPUB 2011 11月2日。

β4整合素的N-糖基化控制角质形成细胞的粘附和运动

附属
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β4整合素的N-糖基化控制角质形成细胞的粘附和运动

吉田敬一郎等。 PLoS一号. .
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摘要

α6β4整合素是半桥粒的重要组成部分,在创伤愈合和肿瘤侵袭中调节细胞迁移。为了阐明N-糖基化对4整合素的作用,我们通过4型整合素零角朊细胞中野生型或N-糖基化缺陷型4整合素(δN 4)的重新表达来研究角质形成细胞的粘附和迁移。α4整合素的N-糖基化对于α4整合素α4整合素的异源二聚体的形成及其在细胞表面的表达并不是必需的,但整合素介导的细胞粘附和迁移需要N-糖基化。伴随着膜微区中4整合素的减少,表达δN 4整合素的细胞中Akt和ERK激活的细胞内信号减少。在4型整合素表达的细胞中,强直交联的δN 4整合素表达细胞减少了ERK的活化,在野生型4整合素表达细胞中达到类似程度。令人惊讶的是,与表达野生型4整合素的细胞相比,在表皮生长因子受体(EGFR)上表达的N-糖链结构的交替,以及在δN 4整合素表达细胞中观察到EGFR和4整合素之间的更强的结合。这些结果清楚地表明,4糖整合素的N-糖基化在角质形成细胞的细胞功能中起着至关重要的作用,通过允许在细胞表面上形成适当的复合物。

利益冲突陈述

竞争利益:作者宣称没有竞争利益存在。

数据

图1
图1。表征N糖基化缺陷型4型整合素表达角质形成细胞。
(a)电位示意图N糖基化位点(n)X(S/T)对4整合素亚单位的影响。对应推论的地点Nβ4整合素亚基的糖基化位点(ASN)三百二十七ASN四百九十一ASN五百七十九ASN六百一十七和ASN六百九十五由标志显示。数字和盒分别表示氨基酸残基的数目和四个细胞内纤连蛋白III型重复。Tm,跨膜区。(b)用对照IgG或抗-I 4整合素AB免疫正常的角质形成细胞的细胞裂解物。免疫沉淀在6% SDS聚丙烯酰胺凝胶上运行,并用生物素化L进行检测。- PHA凝集素(左上面板)和EPHA凝集素(右上板)或抗-4和抗α6整合素ABS(下板)。免疫印迹。黑箭头和白箭头分别表示α4整合素和α6整合素亚基。纵坐标表示标记蛋白KDA中的分子大小。(c)细胞培养过程中表达WT和δN 4整合素的细胞形态。(d)用计算机软件(图像J)计算A中的细胞铺展面积。每个条形表示三重化验的平均±S.D。*P<0.001(未配对t检验)重量与重量(e)从对照laclac-(Lac),WT 4,δn 4整合素表达角质形成细胞的细胞裂解物中,在还原条件下在6%凝胶上运行,在硝化棉膜上涂布,然后用抗4整合素的多克隆抗体对抗-4 4整合素β(F)细胞裂解物进行免疫沉淀。在6% SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行免疫沉淀,并用生物素标记的凝集素或抗-4整合素Ab(G)细胞进行检测,用FACS分析检测表达的WT或δN 4整合素α3、α6、1和4整合素亚单位的表达水平。在分析之前,用指示的整合素ABS或对照IgG孵育细胞,然后用Alexa For共轭的次级ABS孵育,如“材料和方法”所描述的,(h)用抗α6整合素(或上板)或1整合素(下盘)AB检测WT或δN角质形成细胞中的抗α4整合素的免疫沉淀。
图2
图2。δN 4整合素对层粘连蛋白-332细胞活性的影响
(a)在层粘连蛋白-332底物上铺展20分钟后,拍摄标记的角质形成细胞的细胞形态。(b)δN 4整合素对层粘连蛋白-332底物的2μg/ml的细胞粘附活性的影响。实验进行三次三次。*P<0.001(单向方差分析,BoFrONROI后测试)与WT.(C)δN 4整合素对层粘连蛋白-332细胞迁移活性的影响。将培养基中所示的角质形成细胞涂覆在涂有2μg/ml层粘连蛋白332的培养皿上,然后孵育1小时。用时间推移显微镜监测细胞迁移,如“材料和方法”中所描述的。每个条状体代表三个独立的十个细胞在每个测定中的迁移距离的平均±S.D。实验*P<0.001(单因素方差分析,BoFrONROI后测)与WT.(D)在迁移过程中各角质细胞形态的关系。(E)将培养基中的角质形成细胞涂覆在2μg/ml层粘连蛋白-332上。孵育24小时后,将细胞固定并用帕西林单抗染色,随后用二次AB和鬼笔环肽来显示帕西林(绿)和肌动蛋白丝(红色)。(f)确定和计数极化细胞,如“材料和方法”中所描述的。
图3
图3。δN 4整合素对脂筏定位的影响
(a)在1% BRIJ98裂解后,用蔗糖梯度超速离心法分离WT或δN4表达的角质形成细胞。将每个WT和δN角质形成细胞的部分独立地涂布到膜上,用抗4整合素抗体(4)进行检测,然后用抗CaveOL-1抗体(CAV-1)进行检测。(b)将脂质筏级分4和5涂在同一膜上,用4的整合素抗体(4)进行检测,然后用抗体对CaveOL-1(CAV-1)进行检测。(c)密度分析结果显示,图3b中的4整合素与CaveLoL-1条带的比值是整合密度,WT角质形成细胞的4分为1。*P<0.001(单因素方差分析,BoFrONROI后测)与WT.所有印迹均为至少三个独立实验的代表。
图4
图4。δN 4整合素对细胞信号转导的影响
将Lac、WT或δN角朊细胞生长成半汇合,然后按照材料和方法收集每个细胞裂解液。(a和c)20角的来自这些角质形成细胞的细胞裂解物在7.5%或5 - 20% SDS聚丙烯酰胺凝胶上运行,并用磷酸化Akt Ab(A,上板)或磷酸化ERK1/2 Ab(C,上板)进行探测,然后用总Akt ab(A,下板)或总ERK-ab(C,下板)分别进行检测。(b和d)密度分析的结果显示为磷酸蛋白与总蛋白带的比率的整合密度,对于LAC角质形成细胞为1。* P<0.001(单向方差分析,BoFrONROI后测试WT)与δN(E)细胞在无载体培养基上被镀至所指示的底物。孵育30分钟后,收集细胞裂解物并对所指示的抗体进行免疫印迹。所有印迹均代表至少三个独立的实验:无,塑料;FN,纤维连接蛋白;和LM332,层粘连蛋白-332。
图5
图5。α4整合素Ab介导的α6α4整合素簇对ERK磷酸化的影响
(a)在大鼠抗-I 4整合素mAb存在下,WT和δN角质形成细胞在冰上孵育30分钟。将细胞洗涤,然后在37℃下在10℃下在兔抗大鼠次级抗体的存在下(交联,+)或缺失(交联,-)孵育,通过免疫印迹分析细胞ERK的磷酸化。(b)密度分析结果显示磷酸化ERK(PERK)与总ERK(TERK)条带的整合密度,WT角质形成细胞与交联(WT,+)的比值为1。*P>0.05,*P<0.001(单因素方差分析,BONFROONI后测)与交联的WT。所有印迹代表至少三个独立的实验。
图6
图6。Nβ4整合素的糖基化影响NEGFR和半乳糖凝集素-3介导的4型整合素EGFR复合物的糖基化状态。
(a)通过FACS分析对WT和δN角质形成细胞EGFR的细胞表面表达水平。(b)用抗EGFR pAb免疫LAC、WT和δN角质形成细胞的细胞裂解物。免疫沉淀在6% SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行,并用生物素化E进行了检测。- PHA凝集素,L在WT和δN角质形成细胞上进行PHA凝集素、DSA凝集素和ConA lectin或抗EGFR Ab.(C)共价交联。交联后,收集的细胞裂解物用抗EGFR pAb免疫沉淀。免疫沉淀在5 - 20% SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行,并用ABS标记进行检测。
图7
图7。假设效应模型N聚糖对4整合素细胞功能和信号转导的影响
在正常条件下(WT 4整合素),4整合素通过与半乳凝素-3介导的结合与EGFR和层粘连蛋白332(LM332)结合。N-聚糖,诱导它们之间的适度关联,从而有效的整合素聚类、细胞信号转导和细胞迁移。然而,在表达角质形成细胞的δN 4整合素中,缺乏半乳糖凝集素-3 -冥想的4整合素交联和交替。NEGFR的糖基化,导致了4整合素和EGFR之间的蛋白质-蛋白质结合,以及4整合素和层粘连蛋白-332之间的弱关联,这抑制了有效的整合素聚集,从而抑制细胞信号传导和细胞迁移。这个Nβ4整合素的聚糖对于SFKs介导磷酸化发生的脂质筏定位也很重要。

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