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.2012年1月；11（1）：244-53。
doi:10.1158/1535-7163.MCT-11-0592。 Epub 2011年11月4日。

肿瘤抑制因子microRNA-493通过下调RhoC和FZD4降低人膀胱癌细胞的细胞运动和迁移能力

上野Koji Ueno 1, Hiroshi Hirata（广岛）, 沙哈娜·马吉德, 山村宗一郎, 瓦拉赫拉姆·沙赫里亚里, Z劳拉·塔巴塔拜, Yuji Hinoda先生, 拉杰维尔·达希亚
附属公司

肿瘤抑制因子microRNA-493通过下调RhoC和FZD4降低人膀胱癌细胞的细胞运动和迁移能力

上野Koji Ueno等。 Mol Cancer Ther公司. 2012年1月.

摘要

本研究的目的是鉴定膀胱癌中新的肿瘤抑制因子microRNA（miRNA；miR），对其抑制作用进行功能分析，并确定其特定的靶基因。为了探讨膀胱癌中的抑癌基因miR，我们使用SV-HUC-1、T24、J82和TCCSUP细胞进行了miR微阵列研究。与正常SV-HUC-1细胞相比，miR-493在膀胱癌（T24、J82和TCCSUP）细胞中的表达下调。此外，miR-493在膀胱癌组织中的表达显著低于相应的非癌组织。将miR-493转染到T24或J82细胞会降低其细胞生长和迁移能力。在此基础上，为了识别潜在的miR-493靶基因，我们使用靶扫描算法来识别与侵袭和迁移相关的靶癌基因。miR-493降低了FZD4和RhoC的3'非翻译区荧光素酶活性和蛋白表达。miR-493还降低了RhoC和Rock-1的结合。miR-493是一种新的膀胱癌抑癌基因miRNA，通过下调RhoC和FZD4抑制细胞运动。

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数字

图1
图1。10种microRNA在膀胱正常细胞和癌细胞中的表达水平
根据microRNA-microarray数据选择了10个microRNAs（Phalanx Bio Inc）。低：根据MicroRNA-microarray数据，与正常细胞系（SV-HUC-1）相比，膀胱癌细胞系中MicroRNA的表达显著降低。高：基于MicroRNA微阵列数据，与正常细胞系（SV-HUC-1）相比，膀胱癌细胞系中的MicroRNA表达显著更高。还通过实时PCR测量SV-HUC-1和膀胱癌细胞系中的10个微小RNA表达水平，并将其标准化为RNU48。数据以三个独立实验的平均值±SD表示，并与归一化为1的SV-HUC-1细胞中的水平进行比较。
图2
图2。miR-493在膀胱细胞系和膀胱组织中的表达
A.通过实时PCR检测SV-HUC-1和膀胱癌细胞系中MiR-493的表达水平，并将其归一化为RNU48。数据以三个独立实验的平均值±SD表示，并与归一化为1的SV-HUC-1细胞中miR-493的水平进行比较。使用原位杂交技术在组织微阵列中表达B.miR-493。染色强度就地杂交分为0，无染色；1、阳性染色；2、强阳性染色。采用实时荧光定量PCR检测miR-493在原发性正常膀胱癌和移行细胞癌组织中的表达水平。数据以平均值表示，并与归一化为1的SV-HUC-1细胞中的水平进行比较。条形图显示平均值。
图3
图3。miR-493在转染T24和J82细胞中的功能作用
A.在MiR-493前体转染后48小时，采用实时PCR检测膀胱癌细胞株（T24，J82）中MiR-493的表达水平。数据以三个独立实验的平均值±SD表示，并与归一化为1的SV-HUC-1细胞中miR-493的水平进行比较。B.瞬时转染后4天通过MTS分析细胞活力。C.用miR-493转染的细胞进行伤口愈合测定。在转染后48小时，将细胞从6孔板转移到24孔板，并进一步培养24小时。通过刮擦形成伤口，并在24小时（T24细胞）和72小时（J82细胞）后测量伤口。D.miR-493转染细胞的迁移试验。转染72小时后，将细胞加入培养箱。细胞在37°C的5%CO2组织培养箱中培养4小时，用棉签从跨孔滤膜插入物中去除迁移细胞，并用Hema 3染色装置对迁移细胞进行染色。代表性的显微照片以100倍的放大倍数显示。将E.MiR-493和MiR对照转染到T24和J82细胞中。转染72小时后，通过流式细胞仪进行细胞周期分析。
图4
图4。miR-493靶向RhoC和FZD4基因
A.RhoC和FZD4 3′UTR序列、互补miR-493结合序列和3′UTR-甘草酶分析。microRNA.org预测的RhoC/FZD4 3′UTR中的MiR-493结合位点。上部为MiR-493序列。中间是目标野生型序列。较低的是目标突变序列。将带有野生型或突变序列的B.MiR-493和3′UTR载体联合转染到T24细胞中。在转染后48小时测量细胞裂解物的相对荧光素酶活性。将荧光素酶活性水平与用突变型序列的3′UTR载体转染的细胞进行比较。转染miR-493或miR对照的T24和J82细胞中的C.RhoC和FZD4蛋白水平。在输血后72小时，提取总蛋白并通过Western blots进行分析。β-肌动蛋白作为负载对照。
图5
图5。RhoC和FZD4 siRNA敲除对T24和J82细胞的功能影响
A.si-对照和si-RhoC转染膀胱癌细胞（T24，J82）中mRNA和蛋白的表达水平。WB代表蛋白质印迹分析。si-control和si-FZD4转染膀胱癌细胞（T24，J82）中B mRNA和蛋白的表达水平。转染后48小时，采用实时PCR和Western分析对mRNA和蛋白质进行分析。RhoC和FZD4表达归一化为β-肌动蛋白。C和D。si-RhoC和si-FZD4转染体的迁移分析。将si-RhoC/si-FZD4或si-对照转染到T24和J82细胞中。转染72小时后，将细胞加入培养箱。细胞在37°C的5%CO2组织培养箱中培养4小时，用棉签从跨孔滤膜插入物中去除迁移细胞，并用Hema 3染色装置对迁移细胞进行染色。代表性的显微照片以100倍的放大倍数显示。
图6
图6。miR-493和FZD4敲除后Rock-1和RhoC的功能效应
A.miR-493转染后RhoC与Rock-1的结合。转染后72小时，细胞裂解物被抗Rock-1抗体免疫沉淀，并用抗RhoC抗体免疫印迹。IP代表免疫沉淀。WB代表蛋白质印迹分析。B.FZD4 siRNA转染后RhoC与Rock-1的结合。转染后72小时，细胞裂解物被抗Rock-1抗体免疫沉淀，并被抗RhoC抗体免疫印迹。C.miR-493在FZD4/RhoC信号通路中的可能作用。
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