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.2011;6（10）：e25823。
doi:10.1371/journal.pone.0025823。 Epub 2011年10月3日。

利用ATP6功能障碍果蝇模型研究线粒体疾病期间的代谢补偿模式

艾丽西娅·塞洛托 1, Wai Kan Chiu先生, 韦恩·范·沃希斯, 迈克尔·帕拉迪诺
附属公司

利用ATP6功能障碍果蝇模型研究线粒体疾病期间的代谢补偿模式

艾丽西娅·塞洛托等。 公共科学图书馆一号. 2011.

摘要

大量线粒体DNA突变导致线粒体脑肌病：一系列相关疾病，目前尚无有效治疗方法。线粒体脑肌病是一种复杂的多系统疾病，其严重程度不断加重，难以治疗和研究。与慢性线粒体功能障碍相关的致病性和代偿性代谢变化尚不清楚。果蝇ATP6（1）突变为人类线粒体脑肌病建模，并允许研究受影响动物一生中发生的代谢变化和代偿。ATP6（1）动物在无症状时几乎完全丧失ATP合成酶活性和急性生物能量缺乏，但令人惊讶的是，我们在这些动物的症状期内没有发现慢性生物能量缺乏。我们的数据表明，尽管线粒体DNA内源性突变导致慢性线粒体复合体V功能障碍，但动态代谢代偿机制仍能维持正常的能量可用性和活动。ATP6（1）动物通过在发病早期增加糖酵解流量、酮生成和Kreb循环活性来补偿氧化磷酸化的损失。然而，琥珀酸脱氢酶活性降低，线粒体超复合物的形成受到严重破坏，这与ATP6（1）动物的发病机制有关。这些研究证明了代谢代偿机制的动态性质，并强调需要对易驯服的动物系统进行时程研究，以阐明疾病发病机制和新的治疗途径。

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图1
图1。表型进展ATP6（ATP6）1动物。
A） 寿命曲线显示野生型（绿色）和ATP6（ATP6）1（红色）表明寿命缩短了约40%。绿色、黄色和橙色阴影描述了动物行为的变化ATP6（ATP6）1寿命。寿命基于每个基因型总共80只动物。误差为S.E.M.统计分析为对数秩。B） 的表型进展总结ATP6（ATP6）1动物。C） 显示正常发育存活率的图表ATP6（ATP6）1与22°C和29°C下的野生型相比。N个 = 510ATP6（ATP6）122°C时，N = 173野生型，22°C，N = 696ATP6（ATP6）129°C时，N = 29°C时为586野生型。误差是S.E.M.统计分析是学生的t检验。D）ATP6（ATP6）1突变体在22°C（羽化）和29°C（化蛹）的发育速度明显快于对照。N个 = 30两种基因型都有温度。误差是S.E.M.统计分析是学生的t检验。E）ATP6（ATP6）1动物在成年早期表现出较高的繁殖力。灰色代表12∶12的明暗区间。N个 = 462ATP6（ATP6）1，N个 = 139野生型。误差是S.E.M.统计分析是学生的t检验。F） 频闪照明仅在老年人中诱发癫痫样抽搐并随后瘫痪ATP6（ATP6）1动物。年轻的突变体和对照组没有出现抽搐或瘫痪。ATP6（ATP6）1第5天N = 17; 第13天N = 19; 第20天N = 13; 第25天N = 23.野生型5 N天 = 14; 第13天N = 23; 第20天N = 13; 第25天N = 25.误差为S.E.M.第25天的统计分析为双尾Mann-Whitney U检验。另请参见S1A–C和S2A–C。
图2
图2。野生型生物能量学和ATP6（ATP6）1动物。
A） P-Arg:Arg比值显示ATP6（ATP6）1与年龄匹配的野生型相比，这些动物仅在成年第3天和第6天出现。所有突变基因型均为mtATP6（ATP6）1，sesB1/+和野生型控件吨ATP6+，sesB/+。赛斯B1（隐性应激敏感型B突变）是与ANT（腺嘌呤核苷酸转位酶）和ATP6（ATP6）1并在实验前通过RFLP分析验证异质性（数据未显示）。F1雌性后代杂合子赛斯B1具有高突变异质性，并与赛斯B1杂合子对照。N个 = 每个时间点有9个野生型，N = 6ATP6（ATP6）1第3天和第13天，N = 9ATP6（ATP6）1第6天和第20天。误差是S.E.M.统计分析是学生的t检验。B） ATP:ADP比率分析显示，只有年轻突变体的生物能量学也有类似的降低。N个 = 每个时间点有9个野生型，N = 6ATP6（ATP6）1第3天和第13天，N = 9ATP6（ATP6）1第6天和第20天。误差是S.E.M.统计分析是学生的t检验。C） 野生型和野生型之间每毫克组织uM AMP的比较ATP6（ATP6）1动物在第20天表现出老年突变体的AMP适度下降。在ATP6（ATP6）1动物。N个 = 每个时间点有9个野生型，N = 6ATP6（ATP6）1第3天和第13天，N = 9ATP6（ATP6）1第6天和第20天。误差是S.E.M.统计分析是学生的t检验。
图3
图3。年轻人的糖酵解代偿ATP6（ATP6）1动物。
乳酸水平显著增加ATP6（ATP6）1第5天的动物与野生动物进行比较。在第10天和第20天，野生型和突变型之间的稳态乳酸没有变化。N个 = 每个时间点有9个野生型，N = 9ATP6（ATP6）1第5天和第10天，N = 6ATP6（ATP6）1第20天。误差是S.E.M.统计分析是学生的t检验。
图4
图4。生酮补偿ATP6（ATP6）1动物。
A） 生酮代谢途径用于产生酮体（乙酰乙酸盐、丙酮和β-羟基丁酸盐）。酶以红色显示。B&C）酶硫醇化酶和3-羟基-3-甲基-谷氨酸合酶（HMGS）的实时定量RT-PCR显示ATP6（ATP6）1与野生型相比年龄较大的动物。N个 = 每个时间点12个野生型。N个 = 12ATP6（ATP6）1每个时间点。误差是S.E.M.统计分析是学生的t检验。D） β-羟基丁酸的定量显示，幼年动物中β-羟基丁酸的含量显著增加，与野生型相比，随着年龄的增长呈下降趋势。N个 = 9野生型第1–2天，N = 5野生型第13天和第20天。N个 = 6ATP6（ATP6）1第1-2天，N = 5ATP6（ATP6）1第13天和第20天。误差是S.E.M.统计分析是学生的t检验。E） 3-氧乙酸-CoA转移酶参与酮体分解代谢。F） 3-氧代乙酸-CoA转移酶的实时定量RT-PCR显示，随着年龄的增长ATP6（ATP6）1动物与对照组。N个 = 每个时间点12个野生型。N个 = 12ATP6（ATP6）1每个时间点。误差是S.E.M.统计分析是学生的t检验。
图5
图5。呼吸和呼吸商（RQ）随寿命变化。
A） 野生型（绿色）和ATP6（ATP6）1（红色）动物随时间变化。第5天、第10天和第15天ATP6（ATP6）1动物的呼吸速率适度但显著高于野生型动物；然而，到了第20天ATP6（ATP6）1突变体的呼吸速率显著降低。N个 = 每个基因型每个时间点21−24只动物。误差是S.E.M.统计分析是学生的t检验。B） 第15天和第20天的个体动物呼吸率。C） 野生型和ATP6（ATP6）1动物。RQ略有但显著下降ATP6（ATP6）1第5天的动物与野生型相比。N个 = 每个基因型每个时间点6-9个腔室。误差是S.E.M.统计分析是学生的t检验。
图6
图6。琥珀酸脱氢酶和乌头酸酶活性测量。
A） Kreb循环途径；中间产物显示在方框中，酶显示在红色中。灰色方框表示在分离的线粒体中测量酶活性水平的步骤。B）野生型（绿色）和ATP6（ATP6）1（红色）线粒体。ATP6（ATP6）1与野生型相比，线粒体的顺乌头酸酶活性增加。N个 = 每个基因型15个（0-100μg线粒体）。误差是S.E.M.统计分析是学生的t检验。C） 野生型（绿色）和ATP6（ATP6）1（红色）线粒体。ATP6（ATP6）1与野生型相比，线粒体降低了琥珀酸脱氢酶的活性。N个 = 每个基因型9个。误差是S.E.M.统计分析是学生的t检验。
图7
图7。复合物V二聚化和复合物I超复合物形成受损。
A） β和α亚单位抗体的BN-western分析显示，与单体（VM）相比，复合V二聚体（VD）在ATP6（ATP6）1线粒体分离物与野生型对照相比。B） 使用复合物I抗体（NDUFS3）进行的BN-western分析显示ATP6（ATP6）1线粒体。C）将WT（绿色）与ATP6（ATP6）1（红色）：配合物V的二聚体与单体之比和配合物I的超配合物与单体的比。
图8
图8。模型总结了ATP6损伤与正常代谢相比引起的动态代谢变化。
A） 在正常的代谢活动中，氧化磷酸化是细胞内ATP的主要产生者。糖酵解、酮生成和克雷布循环在需要时起作用。B） 在慢性ATP6功能障碍期间，这些利用较少的途径（糖酵解和酮生成）被上调，以补偿氧化磷酰化的损失。复合物V不能形成二聚体，并且缺乏ATP合成酶能力。复合物I超复合物缺失，复合物II活性下降，然而，顺乌头酸酶活性（Kreb循环的一个额外组成部分）显著增加。
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