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.2012年5月31日；31(22):2738-49.
doi:10.1038/onc.2011.454。 Epub 2011年10月10日。

2-脱氧葡萄糖诱导的毒性由Bcl-2家族成员调节，并通过拮抗淋巴瘤细胞系中的Bcl-2而增强

O扎戈罗德纳 1, S M马丁, D T鲁特科夫斯基, T库瓦纳, D R斯皮茨, C M克努森
附属公司

2-脱氧葡萄糖诱导的毒性由Bcl-2家族成员调节，并通过拮抗淋巴瘤细胞系中的Bcl-2而增强

O扎戈罗德纳等。 癌基因. .

摘要

用糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖（2DG）靶向改变的癌细胞代谢是一种可行的治疗策略，但2DG对淋巴瘤细胞的作用及其作用机制尚不清楚。五个T细胞淋巴瘤系和两个B细胞淋巴瘤系被证明对2DG高度敏感。对细胞死亡途径的检查表明，2DG处理细胞中的促凋亡蛋白Bax“激活”和caspase裂解。然而，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性的一种有效抑制剂Q-VD-OPh对死亡的保护作用最小。相反，过度表达抗凋亡蛋白Bcl-2可显著提高经2DG处理的细胞的存活率，而Bcl-2拮抗剂对2DG处理细胞无效。2DG上调BH3-only成员Bim和Bmf的表达，靶向Bim的shRNAs免受2DG毒性的影响，这表明Bim是2DG毒性中的关键介体。2DG还诱导了GADD153/CHOP的表达，GADD153/CHOP是内质网（ER）应激的标志物，也是已知的Bim激活剂。甘露糖是一种已知的缓解内质网应激的试剂，能暂时防止2DG诱导的细胞死亡。2DG对能量代谢的影响检查显示，30分钟内ATP水平下降，而Bcl-2或甘露糖均未影响。这些结果表明，内质网应激似乎是2DG诱导淋巴瘤细胞死亡的限速因素，这种细胞杀伤受Bcl-2蛋白家族调控。Bcl-2抑制联合2DG可能是淋巴瘤的有效治疗策略。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：作者均无任何经济利益或其他与本作品相关的利益冲突。

数字

图1
图1。TCL对2DG治疗一致敏感
（A） 将小鼠T细胞淋巴瘤细胞（TCL）以200000/mL的速度接种在含有20 mM 2DG的Adv.RPMI培养基中。使用Guava ViaCount染料排除试验（0-24小时）评估生存能力。（B） 将小鼠胸腺细胞（WT-Thy）和TCL以200000/mL的速度接种在含有20 mM 2DG的Adv.RPMI培养基中，持续指定的时间。通过Guava ViaCount染料排除试验评估生存能力。数据表示平均存活率±S.D.（C）TCL1和TCL3在指定时间内用20 mM 2DG和50μM Q-VD-OPh（qVD）处理。Western blot检测caspase 3和PARP的裂解。U=未剥离，C=劈开。（D） 如图所示，用20 mM 2DG和50μM Q-VD-OPh（qVD）处理细胞。在指定的时间，使用Guava ViaCount染料排除试验评估活性。
图2
图2。2DG处理后Bax被激活
如图所示，用2DG（20 mM）和Q-VD-OPh（50μM，qVD）处理TCL。4小时（TCL3）或6小时（TCL1）后，对细胞进行Bax活性构象标记，并按照所述方法进行流式细胞术分析。以下样品的直方图显示：2DG处理的细胞用同型对照抗体染色（灰色阴影），未经处理的细胞使用抗-Bax染色（细黑线），2DG处理细胞使用抗-Bax（粗黑线）、2DG+qVD处理细胞使用防-Bax（灰色粗虚线）。
图3
图3。Bcl-2表达可防止2DG毒性
（A） 慢病毒转染Bcl-2荧光素酶质粒或荧光素素酶控制质粒后TCL1和TCL3的Western blot（如方法所述）。对照组（ctrl）和TCL-Bcl-2细胞（Bcl-2）用20 mM 2DG处理，并在指定的时间通过Guava ViaCount染料排除试验评估生存能力。数据代表平均存活率±S.D.（B）对照（ctrl）和TCL-Bcl-2（Bcl-2）系的克隆原性存活率在24小时2DG（20mM）处理后进行测量，如方法中所述。数据表示来自三个96 well板±S.D.（C）的CFU/孔的平均计算值。用20 mM 2DG处理TCL（TCL1，TCL1-Bcl-2，6 h；TCL3，TCL3-Bcl-2，4 h），采集、固定并染色，以检查Bax活化，如图2所示和方法。以下样品的直方图显示：未处理的TCL（细黑线）、20 mM 2DG处理的TCLs（粗黑线）和20 mM 2DG处理的TCL-Bcl-2细胞（粗灰线）。（D） 用20 mM 2DG处理TCL和TCL-Bcl-2细胞指定的时间，并使用方法中描述的生物发光细胞检测试剂盒测量ATP水平。数据表示平均ATP水平±S.D。
图4
图4。Bcl-2拮抗剂ABT-737恢复并诱导对2DG的敏感性
（A） Bcl-2过度表达的TCL按照2DG和ABT-737（0.5μM）的指示进行治疗。在指定的时间通过Guava ViaCount评估生存能力。数据表示平均存活率±S.D.（B）非转导TCL按照2DG和ABT-737（0.5μM）的指示处理24小时。由Guava ViaCount评估生存能力。数据表示平均存活率±S.D。
图5
图5。ABT-737抑制2DG引起的Bim和Bmf BH3-only蛋白与Bcl-2的结合
（A） 如图所示，用2DG（20 mM）处理TCL细胞6小时。蛋白质水平通过Western blot进行评估。（B） 如图所示，用2DG（20 mM）处理TCL-Bcl-2细胞24小时。蛋白质水平通过Western blot验证。（C） 如图所示，用2DG（20 mM）处理TCL-Bcl-2细胞24小时，用0.5μM ABT-737处理最后3小时。用方法中描述的Bcl-2抗体进行免疫沉淀。蛋白质水平通过Western blot验证。B=珠，L=裂解物，S=上清液。
图6
图6。下调Bim蛋白抑制2DG毒性
（A） 用shBIM逆转录病毒质粒转导细胞。采用Western blot检测Bim蛋白水平，肌动蛋白作为负荷对照。通过UVP（方法）测定Bim与肌动蛋白水平的比率，并将未经处理的载体控制细胞指定为标准化比率1.0。（B） 用不同浓度的2DG处理细胞，并在指定时间用番石榴ViaCount监测细胞活力。每个细胞系单独选择2DG处理的持续时间，以便控制细胞在该时间点的存活率预计在30%到70%之间。数据表示平均存活率±S.D。
图7
图7。2DG治疗后Bim上调和ER应激
（A） 如图所示，用20 mM 2DG和20 mM甘露糖处理细胞。活性由Guava ViaCount监测。数据表示平均存活率±S.D.（B）细胞用20 mM 2DG和/或20 mM甘露糖处理6 h，如图所示。mRNA水平Gadd153和加德34与未处理样品中的水平相关。数据表示三个独立样本的平均mRNA水平±S.D。（C） 如图所示，用20 mM 2DG、20 mM甘露糖或5μM衣霉素（TM；ER应激阳性对照）处理细胞6 h。的拼接新业务流程1mRNA通过常规RT-PCR进行评估，显示拼接（S）和非拼接（Us）形式。显示了复制样本。（D） 如图所示，用20 mM 2DG和20 mM甘露糖处理细胞6 h。蛋白质水平通过Western blot测定，如方法部分所述。按照方法所述测量ATP水平。数据表示平均ATP水平±S.D.（E）细胞用20 mM 2DG和20 mM甘露糖处理6 h和24 h，如图所示。蛋白质水平通过Western blot进行评估，ATP水平如（D）所示。
图8
图8。B细胞淋巴瘤细胞系对2DG治疗敏感
如图所示，用不同浓度的2DG单独（Ctrl）或与2μM ABT-737（ABT）或2 mM甘露糖（Mann）联合治疗小鼠B细胞淋巴瘤细胞系。治疗后18小时通过PI排除法评估生存能力。
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